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苔藓植物的组织培养研究已经历了一个多世纪,但发展缓慢。主要原因在于苔藓植物非常矮小,植物体大多是由单层细胞组成,材料消毒不彻底,消毒过度时会褐化,大量获得苔藓植物配子体无菌材料仍存在很多困难。进一步探索苔藓植物的组织培养技术,构建苔藓植物配子体再生体系,对于开展苔藓植物分子生物学、生理学、植物化学等方面具有重要的意义。本文分别采用外植体和孢子做为实验材料,研究了毛尖紫萼藓、东亚小金发藓、小石藓、拟草藓、淡叶长喙藓、波叶仙鹤藓几种藓类植物配子体再生体系的建立,探讨了激素等培养条件对其配子体分化和生长的影响,主要结论如下:
⑴利用毛尖紫萼藓孢子和茎尖做外植体进行组织培养均可获得再生配子体植株,两种方法备有所长。直接将野外采回的大量茎叶体进行外植体培养,材料获得容易,但材料的消毒十分关键。利用毛尖紫萼藓外植体茎尖进行组织培养,消毒的最佳方法是用0.05%浓度的氯化汞对顶端外植体消毒60~70秒,然后用无菌水冲洗7~8次。用野外采到新鲜成熟的孢子培养得到配子体的速度相对较快,在有孢子的情况下可以采用孢子培养。将孢子用次氯酸钠进行消毒,制成孢子悬浮液,接种于培养基中,孢子萌发的最适培养基是改良的MS培养基(将MS培养基中无机盐含量调为原来的十分之一,添加同样的有机成分,不添加蔗糖)。萌发后的孢子转移到不添加葡萄糖的Beneck培养基,待轴丝体分化出芽体,并进一步长成幼嫩的配子体后,再将幼嫩的配子体再重新转接到10g/L葡萄糖的Beneck培养基中,继续长大即获得了纯化的毛尖紫萼藓再生配子体。
⑵研究了培养基的pH值、培养基成分以及不同激素对毛尖紫萼藓配子体再生体系形成的影响,结果表明:(1)在实验采用的pH值范围内,培养基pH对原丝体生长影响不大。(2)0.25mg/L6-BA对毛尖紫萼藓原丝体发育有明显促进作用。(3)糖可以促进原丝体的大量生长,在葡萄糖浓度0~10g/L范围内,原丝体发育量有较为明显的增加,而再高的葡萄糖浓度反而对原丝体生长不利。(4) BCD培养基中添加酒石酸铵,可以诱导毛尖紫萼藓轴丝体的形成,轴丝体继续发育则分化出芽体,进而发展为配子体。(5)无糖、低浓度无机盐的培养基更有利于孢子的萌发,培养基中生长素的浓度对孢子萌发后的原丝体生长有一定的影响,6-BA浓度为10-4M,IAA浓度为10-6M时原丝体生长速率最快。
⑶研究了小石藓、淡叶长喙藓、东亚小金发藓、拟草藓、波叶仙鹤藓5种崂山产藓类植物孢子萌发与原丝体发育的特征以及配子体的再生体系的建立,结果表明本实验选用的5种藓类植物的孢子萌发均属于孢子壁外萌发。东亚小金发藓和波叶仙鹤藓的原丝体发育类型为葫芦藓型(Funaria—type)。不同藓类原丝体发育特征往往与其环境有关,小石藓、拟草藓和淡叶长喙藓的原丝体发育类型则为真藓型。小石藓与毛尖紫萼藓生长环境同为干旱的岩石表面,绿丝体细胞都为较短的圆柱形,绿丝体分枝都短而密集,由一个孢子萌发形成的原丝体系都是形成一团。淡叶长喙藓生于阴湿岩面上,绿丝体细胞长管状,分枝细长。
⑷东亚小金发藓、小石藓、拟草藓、淡叶长喙藓和波叶仙鹤藓很容易获得其成熟孢蒴,而且孢蒴数量多,易于保存,孢子萌发率高,因而采用其孢子培养建立配子体再生体系更快更方便。但不同藓类檬物需要采取不同的消毒方法。在相同的培养情况下,淡叶长喙藓孢子接种两个月左右即可获得大量再生配子体;而同为石生藓类的小石藓孢子萌发后,需将其原丝体转接入添加6-BA的培养基中,才能较快分化出多数配子体。