血管紧张素II（angiotensinII,AngII）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应因子，是一种多功能的血管活性肽。通过活化多条信号通路，参与心血管系统生理功能的调节，并介导多种心血管疾病发生发展的病理过程。AngII急性刺激可诱导血管收缩，升高血压；而长时间慢性刺激可促进血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖、肥大及衰老。SM22α又被称为transgelin，是一种平滑肌分化标志物，高表达于哺乳动物平滑肌中，被广泛用于平滑肌细胞的鉴定。SM22α的主要功能是与actin结合，促进actin细丝聚合及捆绑。我室以往的研究证实，SM22α通过促进actin纤维聚合成束，进而增强VSMC收缩性；此外，SM22α还参与调节细胞增殖、氧化应激和炎症相关信号转导分子的活性。然而，SM22α是否参与收缩信号分子活性的调节以及分子机制尚不清楚。细胞内SM22α蛋白水平与VSMC的表型状态密切相关，丝裂原和炎性因子可诱导该蛋白表达下调。然而，在多种衰老细胞中，发现SM22α表达上调，该蛋白已成为非肌细胞衰老的新标志物。但是，SM22α是否参与VSMC衰老的调节，尚缺乏深入的研究。本研究主要探讨SM22α在AngII诱导的VSMC收缩及衰老中的作用。方法：本研究利用SM22α基因敲除小鼠经背皮下植入AngII微渗透泵复制高血压模型，用智能无创血压计检测小鼠血压，在整体水平探讨病理情况下SM22α与血压的关系；用微血管张力测定仪检测血管环等长张力；用细胞长度测量和胶原胶收缩分析分别检测细胞收缩性；通过敲低SM22α及特异性信号通路阻断剂，确定受其调节的信号途径及靶分子；用RT-PCR、Western blot检测mRNA及蛋白质表达变化；用免疫共沉淀分析和免疫双荧光染色确定蛋白质相互作用；用免疫沉淀分析蛋白质泛素化修饰；用AngII慢性刺激建立VSMC衰老模型，探讨SM22α在AngII诱导的VSMC衰老中的作用。结果：1SM22α通过调节ERK1/2活性参与AngII诱导的VSMC收缩1.1SM22α促进AngⅡ诱导的血管平滑肌收缩选雄性Sm22α+/+及Sm22α-/-小鼠复制高血压小鼠模型。植泵前，Sm22α+/+小鼠的收缩压和舒张压分别为（118.8±2.2）和（76.4±2.7）mmHg，Sm22α-/-小鼠的收缩压和舒张压分别为（111.7±1.9）和（72.5±2.4）mm Hg，二者的基础血压无显著差异。植泵后，两种基因型小鼠的收缩压和舒张压均随着时间逐步升高，至21天时，Sm22α+/+小鼠的收缩压和舒张压分别为（179.5±2.3）和（130.5±2.8）mm Hg，Sm22α-/-小鼠的收缩压和舒张压分别为（158.3±1.8）和（109.3±3.1）mm Hg。Sm22α-/-小鼠的血压显著低于Sm22α+/+小鼠（P <0.05）。取小鼠主动脉进行血管环张力测定，绘制主动脉血管环对AngII的浓度-收缩曲线，结果表明，AngII可诱发两种基因型小鼠的主动脉环产生明显的收缩应答。但是，Sm22α-/-小鼠主动脉环的收缩反应性较Sm22α+/+小鼠明显减弱，表现为浓度-收缩曲线明显右移，半数有效浓度（EC50）由5.57nmol/L右移至12.13nmol/L（P <0.05）；收缩峰值降低，在Sm22α+/+小鼠的主动脉环中，AngII引起的收缩峰值为45.5±4.3%，而Sm22α-/-小鼠的主动脉环的收缩峰值为28.4±4.0%(P <0.05）。敲低SM22α后，AngII诱导的VSMC长度变化百分比及胶原胶面积变化百分比均显著降低（P <0.05）。并且Sm22α-/-小鼠VSMC对AngII的收缩性显著降低。1.2ERK1/2通路介导AngⅡ诱导的血管平滑肌收缩AngII刺激2min时，ERK1/2的磷酸化水平即有显著升高，5min时达高峰；其下游靶蛋白caldesmon磷酸化时程与ERK1/2基本一致。细胞长度变化百分比于AngII刺激5min后达峰值，时程与ERK1/2磷酸化基本一致。PD98059预孵育2h后，AngII诱导的ERK1/2磷酸化受到显著抑制，伴随caldesmon的磷酸化水平显著降低。用PD98059预处理小鼠主动脉环30min后，AngII诱导的收缩反应显著降低。浓度-收缩曲线明显右移（EC50为8.90nmol/L）；收缩峰值由43.4±4.1%降至32.5±4.2%。在细胞水平，PD98059预处理后，AngII诱导的VSMC长度变化百分比及胶原胶面积变化百分比均显著降低。1.3SM22α调节AngII诱导的ERK1/2激活用小干扰RNA敲低内源性SM22α后，观察AngII短时间（5min）刺激，ERK1/2的活化情况。结果表明，AngII刺激后，对照组及SM22α敲低组ERK1/2磷酸化水平均有升高，但SM22α敲低组的上升幅度显著低于对照组（P <0.05）。AngII刺激5min后，原代培养的Sm22α-/-组VSMC的ERK1/2磷酸化水平较Sm22α+/+组显著降低。2SM22α通过促进MKP3降解调节AngII-ERK1/2通路信号转导2.1SM22α通过MKP3调节AngII诱导的ERK1/2通路活化AngII刺激5min后，SM22α敲低组及对照组MEK磷酸化水平均有显著升高，但两组的升高幅度并无显著差异。而在敲低SM22α后，其磷酸酶MKP3的表达明显上调，同时伴有AngII诱导的ERK1/2磷酸化减弱。Sm22α-/-小鼠血管组织中MKP3的表达水平较Sm22α+/+小鼠显著升高。用MKP3抑制剂BC（I10μmol/L）预孵育30min可逆转敲低SM22α对ERK1/2通路活化的抑制作用。2.2MKP3通过抑制ERK1/2参与AngII诱导的血管平滑肌收缩BCI预处理后，小鼠主动脉对AngII的收缩应答显著增强，浓度-收缩曲线明显左移（EC50为3.83nmol/L）；收缩峰值由46.1±3.8%升至61.1±5.1%。在细胞水平，BCI (10μmol/L)预孵育2h后，AngII诱导的VSMC长度变化百分比及胶原胶面积变化百分比均显著增加（P <0.05）。与GFP空质粒对照组相比，过表达GFP-MKP3后，AngII诱导的VSMC长度变化百分比及胶原胶面积变化百分比均显著降低。BCI (10μmol/L)预孵育2h后，ERK1/2及caldesmon的磷酸化水平显著升高；而过表达GFP-MKP3融合蛋白后，与转染GFP空质粒的VSMC相比，ERK1/2及caldesmon的磷酸化水平显著降低。2.3SM22α抑制MKP3与ERK1/2的相互作用免疫共沉淀结果显示，在未刺激时，MKP3与ERK1/2即有较弱的相互作用；敲低SM22α后，MKP3与ERK1/2的结合量显著增加。与Sm22α+/+小鼠相比，Sm22α-/-小鼠VSMC中二者的相互作用增强。细胞免疫荧光染色分析结果显示，敲低SM22α后，细胞内MKP3荧光强度及其与ERK1/2的共定位均显著增加。2.4SM22α促进MKP3的泛素-蛋白酶体降解过程敲低SM22α后，VSMC中MKP3的mRNA水平并无显著改变，并且Sm22α+/+与Sm22α-/-两种基因型小鼠主动脉组织中MKP3的mRNA水平也无显著差异。用放线菌酮阻断新生蛋白质合成，测定蛋白质半寿期。结果表明，MKP3半寿期很短，约为30min左右；90min时，蛋白降解明显。敲低SM22α后，MKP3的半寿期延长至90min以上。用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，观察对MKP3半寿期的影响。结果显示，MG132（10μmol/L）预处理2h可显著延长MKP3的半寿期。泛素化分析结果显示，敲低SM22α后，MKP3的泛素化水平显著降低。3SM22α促进AngII诱导的VSMC衰老3.1SM22α在AngII诱导的VSMC衰老中表达上调AngII刺激3天后VSMC中SA-β-gal阳性染色细胞百分比为5.4±1.4%，与对照组（6.5±1.6%）相比，无显著差异；刺激5天，SA-β-gal阳性细胞百分比为43.9±5.3%，显著高于对照组（22.1±4.1%，P <0.05），刺激7天和10天，SA-β-gal阳性细胞数大幅度增加，阳性细胞百分比高达78.9±5.2%及92.3±4.4%。AngII刺激7天及10天，p21和p53的表达显著高于对照组（P <0.05），并且表达量随刺激时间延长而升高；相反，PCNA的表达随刺激时间逐渐降低。AngII刺激5天后，SM22α的表达表达显著高于对照组（P <0.05），并随AngII刺激时间延长而增加。3.2AngII上调SM22α基因转录活性AngII刺激3天，SM22α的mRNA水平开始升高，与刺激前相比，约升高3.8倍；至10天时达到峰值，约为刺激前的12.1倍，与其蛋白水平变化一致。而AngII刺激不同时间，SM22α的泛素化水平没有显著改变。3.3SM22α促进AngII诱导的VSMC衰老在VSMC中敲低SM22α，观察对细胞衰老的影响。敲低SM22α后，AngII诱导的SA-β-gal阳性细胞百分比分别为25.3±4.3%和32.3±4.6%较对照组（79.2±4.2%及89.2±5.2%）显著降低（P <0.05）。并且，衰老标志蛋白p21及p53的表达显著减少，而增殖标志PCNA表达上调（P <0.05）。结论：1. SM22α通过调节ERK1/2通路活化参与AngII诱导的血管平滑肌收缩。2. SM22α通过促进MKP3的泛素-蛋白酶体降解和抑制MKP3与ERK1/2的相互作用，进而调节AngII诱导的ERK1/2通路活化。3. SM22α促进AngII诱导的VSMC衰老。4. SM22α是一种新的血管收缩信号转导分子的调节因子，参与调节AngII诱导的血管生理及病理学过程。