熊果苷(arbutin)是从多种植物中分离得到的天然活性物质,其化学名为4-羟苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(简称β-熊果苷)。化妆品中广泛应用于去除皮肤雀斑、老人斑、黄褐斑等色素沉积导致的色斑当中。但是,由于熊果苷能够在一定条件下被健康人体表面的微生物转化为氢醌,对人体带来致敏风险。引起不良反应的祛斑类产品中约59%的产品配方使用了熊果苷原料[1],因此,探讨通过中药挥发油促透作用减少熊果苷的含量,具有较好的应用价值。柠檬(Citrus lemon(L)Burm.F.)属于芸香科(Rutaceae)柑橘属常绿小乔木,含有丰富的挥发油,因其具有滋润养颜、淡化色斑、美白嫩肤等功效,常作为功能性成分应用在具有保湿、祛斑、美白的爽肤水中。另外,由于其较好的促进渗透的作用,也常作为天然促透剂使用,广泛应用于化妆品、医药等领域。本论文以β-熊果苷为主要功能性活性物质,柠檬挥发油作为具有辅助美白功能的促透剂,筛选复配处方,制备具有美白祛斑功效的特殊化妆品。一方面减少β-熊果苷的使用量,另一方面增加具有协同美白功能的天然促透剂,为日后的工业生产提供理论依据。主要的研究内容如下:(1)建立适用于测定β-熊果苷原料含量的高效液相方法;建立测定柠檬挥发油中柠檬烯的气相检测方法,并分别测定两种原料的含量。(2)通过单因素实验确定柠檬果皮浸泡时间、液料比及提取时间对挥发油得率的影响,采用响应面(BBD)设计法优化柠檬挥发油的提取工艺。(3)采用体外经皮渗透实验方法,考察挥发油自身透皮特性与促进β-熊果苷的透皮性能,筛选出柠檬挥发油与β-熊果苷的使用量。(4)采用正交试验设计法对制剂处方进行优化,分别以乳化剂、润肤剂、增稠剂及保湿剂用量作为四个因素,进行四因素三水平试验L9(3)4,将最佳处方条件下制备的制剂命名为LA霜;通过制剂的质量控制方法,考察LA霜的成型性、稳定性;考察LA霜中柠檬挥发油对β-熊果苷的促渗效果。(5)通过生化酶法测定LA霜的美白功效。初步探讨LA霜的豚鼠皮肤刺激性,按照《2007版化妆品规范》中皮肤刺激实验的评分标准评分并进行皮肤组织学检查。结果:(1)建立β-熊果苷的HPLC检测方法,测定β-熊果苷原料的含量为95.0%。该方法专属性良好,精密度RSD为1.50%,重复性RSD为0.50%,加样回收率RSD为1.57%,稳定性为在24h内稳定,RSD为0.38%,该方法结果良好,稳定可行;采用内标法测定自提柠檬挥发油中的柠檬烯的平均百分含量为33.72%。该方法精密度RSD为4%,重复性RSD为1.13%,加样回收率RSD为1.3%,稳定性为在24h稳定,RSD为1.08%,该方法结果良好,稳定可行。(2)响应面法优化的柠檬挥发油提取工艺为:液料比(ml/g)为10:1,提取时间3.35h、浸泡时间5h,此工艺条件下提取率为2.28%。(3)柠檬挥发油自身透皮实验中:柠檬烯的透皮速率呈浓度依赖性,单位面积累积透过量在2-24h之间呈现明显的规律性:5.0%>3.0%>1.0%;表明柠檬挥发油具有较高的皮肤透过性。柠檬挥发油促进β-熊果苷体外促透实验:①等量的β-熊果苷,增渗倍数ER比较,促透能力为:3.0%氮酮>2.0%氮酮>3.0%挥发油>2.0%挥发油>1.0%氮酮>1.0%挥发油。3.0%的挥发油与3.0%氮酮的ER分别是1.9465、1.9687,差距较小,故选择3.0%的挥发油作为制剂的促透剂。②以3.0%挥发油作为促透剂,浓度分别为1.0%,2.0%,3.0%的β-熊果苷增渗倍数分别为1.9499、1.9005、1.9315。进一步计算得:与β-熊果苷3.0%的常规用量比较,加入3.0%的柠檬挥发油复配后,可减少1.45%的β-熊果苷的使用量,确定β-熊果苷的用量为1.55%。(4)正交实验L9(3)4最佳处方结果:在100g处方组成中,去离子水85g、甘油9g、油酸聚乙二醇甘油酯3g、聚乙二醇-7-硬脂酸酯2g、硬脂酸甘油酯2g,二甲基硅油3g、蜂蜡1.5g、卡波姆0.15g、汉生胶0.25g、柠檬挥发油3.0g,β-熊果苷1.55g。此组合制得的霜剂物理稳定性好,霜剂颗粒均匀细腻,简称LA霜。LA霜的渗透速率:5.2227 ug?cm-2?h-1,LA霜促透剂阴性的渗透速率:3.3782 ug?cm-2?h-1,增渗1.55倍。说明LA霜中加入柠檬挥发油可以有效促进β-熊果苷的经皮吸收。(5)美白功效实验,最佳实验条件是:L-酪氨酸溶液的量为0.8m L、酪氨酸酶的量为0.40m L、恒温水浴时间为10min、反应时间为5min。在该最佳反应体系中,测定了LA霜对酪氨酸酶的抑制作用。测定结果为起始抑制率:LA霜>LA霜柠檬挥发油阴性样品>LA霜β-熊果苷阴性样品;抑制速率:LA霜>LA霜柠檬挥发油阴性样品>LA霜β-熊果苷阴性样品;最大抑制率:LA霜≈LA霜柠檬挥发油阴性样品>LA霜β-熊果苷阴性样品。说明LA霜的酪氨酸酶抑制率较好,具有良好的皮肤。在刺激性实验中,结果如下:①经独立样本检验统计分析,在多次实验中,在3%挥发油LA霜p>0.05,完整皮肤与空白基质组比较无显著性差异,对完整皮肤无刺激性;对破损皮肤p<0.05,与空白基质组比较有显著性差异,对破损皮肤有轻度刺激。在5%与8%挥发油LA霜p<0.01,与空白基质组比较有极显著性差异,表明此浓度LA霜对完整与破损皮肤都有轻度和中度的刺激性。②皮肤组织学检查,3%挥发油LA霜使得完整皮肤的角质层松动,但是表皮连贯,厚度均匀,未损伤真皮和毛囊。高浓度的LA霜对完整与破损皮肤可致其角质层断裂、脱落,表皮不连贯、厚度不均匀,甚至改变真皮中毛囊的形态并阻止其生长,产生毛囊溢出。结论:(1)LA霜最佳处方(100g):柠檬挥发油3.0g、β-熊果苷1.55g、去离子水85g、甘油9g、油酸聚乙二醇甘油酯3g、聚乙二醇-7-硬脂酸酯2g、硬脂酸甘油酯2g、二甲基硅油3g、蜂蜡1.5g、卡波姆0.15、汉生胶0.25g。此处方制得的霜剂稳定性好,颗粒均匀细腻。美白功效测定,LA霜具有较强的酪氨酸酶抑制作用,表明LA霜具有良好的皮肤美白作用,可作为特殊化妆品进行开发。(2)在LA霜中,柠檬挥发油能够对β-熊果苷起到较好的促透效果,在3%柠檬挥发油下促透作用与同等浓度氮酮相当,能够明显减少β-熊果苷用量,增加其皮肤外用的安全性。