鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)是导致鸭、鹅等鸟类发生以肝周炎、心包炎、气囊炎为典型症状的一种高致病性、接触传染性疾病的病原菌。该菌主要感染10~35日龄的雏鸭,发病率可达90%以上,死亡率最高可达100%。该病菌广泛存在于世界各地的养鸭场,鸭场一旦发生该病则很难彻底清除感染,严重影响了养鸭业的发展。目前,该病的控制主要依靠抗生素,但由于该菌不断增强的对多种抗生素的耐药性以及食品安全的需要,R.anatipestifer疫苗得以广泛的应用。目前,实际生产上使用的R.anatipestifer疫苗存在着效果不理想以及副作用较强的问题,为提高R.anatipestifer疫苗的安全性和效力,需要对此类疫苗进一步的研究突破。参考百日咳菌苗生产工艺发现该疫苗曾经也存在此类问题,但是通过改用了戊二醛灭活的方法后极大的改善了疫苗的刺激性和副作用的问题,此类举措为R.anatipestifer疫苗的改进提供了方向。目前,绝大多数R.anatipestifer疫苗都是使用甲醛作为灭活剂,而甲醛虽是当下应用最广泛的灭活剂,但是其破坏免疫原性、刺激性和致癌性等弊端早已报道。故通过比较不同灭活方法对R.anatipestifer免疫原性的影响,对于R.anatipestifer疫苗的改进具有重大的意义。R.anatipestifer灭活疫苗的传统灭活工艺是加入终浓度为0.1~0.38%的甲醛溶液在37℃环境下灭活24h以上。参照相关文献后,除甲醛灭活外,试验设置有热灭活、戊二醛灭活和聚维酮碘灭活四类方法反复进行灭活效果监测试验探索R.anatipestifer的灭活条件。试验从不同作用浓度、不同作用时间和作用温度三个角度设计初步灭活方案后,再通过试验改进试验设计,重复试验进而筛选出四类能够完全灭活R.anatipestifer的灭活方案。最后得出能够完全灭活此次试验浓度范围内(A525=2.0±0.05)的R.anatipestifer菌液的灭活方法有:(1)56℃水浴30min;(2)52℃水浴75min;(3)终浓度为0.03%~0.2%甲醛灭活(37℃,24h);(4)终浓度为0.1%~0.2%戊二醛灭活(4~8℃,24h);(5)终浓度为0.74%聚维酮碘灭活(37℃,24h)。依据以上不同的灭活方法制备R.anatipestifer血清1型SC株灭活菌液,经灭活检验合格后制成对应组别的油乳剂灭活苗。先后选用了1日龄非免健康雏鸭49只和90只,饲养至4日龄接种免疫原,18日龄相同剂量(10~9CFU/mL,0.3mL/只)同源菌株(R.anatipestifer-SC)菌液攻毒进行了两次的免疫攻毒保护试验。第一次试验结果表明:终浓度0.1%甲醛灭活组和终浓度0.2%戊二醛灭活组以及终浓度0.74%聚维酮碘灭活组保护效果最佳,其保护率均高达100%(7/7),56℃,30min灭活组和终浓度0.03%甲醛灭活组次之,保护率为85.7%。第二次免疫攻毒保护试验结果表明:56℃水浴30min、52℃水浴75min、终浓度0.1%甲醛灭活组和终浓度0.2%戊二醛灭活组保护效果最佳,其保护率为66.6%(6/9),终浓度0.065%甲醛灭活组保护率为55.5%(5/9),而终浓度0.03%甲醛灭活组、0.1%戊二醛灭活组和终浓度0.74%聚维酮碘灭活组保护率只有44.4%(4/9)。两次试验结果表明:热灭活56℃,30min、52℃,75min、0.1%甲醛灭活和0.2%戊二醛灭活制备的疫苗较为理想,但0.74%聚维酮碘灭活制备的免疫原保护效力降低且不稳定。故热灭活和戊二醛灭活R.anatipestifer的方法在制备R.anatipestifer灭活疫苗方面有望替代传统甲醛灭活工艺,为R.anatipestifer灭活疫苗的改进提供了新的方向。依据免疫攻毒保护试验的结果,设置了56℃、52℃、0.1%甲醛、0.2%戊二醛和0.74%聚维酮碘五个试验组和一个健康未免疫组,每组设有5只试验鸭,使用第二次免疫攻毒保护试验制备的对应组疫苗接种(0.2mL/只),免疫后第14天后采血制备血清。此次试验先后有两批试验鸭,第一批于5日龄接种,第二批于26日龄接种。将制备的血清样品使用标化后的R.anatipestifer-SC染色抗原进行微量凝集试验,检测其血清的抗体水平。结果表明:非免健康鸭的MAT背景值为0~1 log2;第一批5日龄免疫的试验鸭,56℃、52℃、0.1%甲醛、0.2%戊二醛和0.74%聚维酮碘组的MAT平均效价分别为2.90±1.34、2.35±0.65、3.40±1.29、2.50±0.71、3.35±1.31,各组的组间差异均不显著(P>0.5);第二批26日龄免疫的试验鸭,56℃、52℃、0.1%甲醛、0.2%戊二醛和0.74%聚维酮碘组的MAT平均效价分别为5.90±0.80、6.35±0.74、5.80±0.59、7.35±0.60、6.40±0.45,其中戊二醛组的效价在第一次试验中显著高于其它组别(P<0.05),另外四组差异不显著(P>0.05)。因此,5日龄免疫时,使用56℃、52℃、0.1%甲醛、0.2%戊二醛和0.74%聚维酮碘的五种灭活方法的免疫原在诱导鸭产生抗体方面的效力并无太大的差异,但在26日龄免疫时,0.2%戊二醛灭活的免疫原在诱导鸭产生抗体方面效力会优于其它组灭活方法。