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目的研究与肿瘤细胞多药耐药性(MDR)相关的两个基因MDR1、MRP对非小细胞肺癌(NSCLC)的多药耐药性的关系。采用RNA干扰技术(RNAi),构建表达Si-MDR1和Si-MRP的重组慢病毒PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP,转染人肺癌细胞A549及其耐顺铂细胞株A549/DDP,研究化疗药物对RANi后细胞的杀伤效果,探讨治疗NSCLC的新方法。研究共分三部分:第一部分MDR1、MRP基因SiRNA有效位点的筛选;第二部分Si-MDR1、Si-MRP重组慢病毒载体的构建;第三部分Si-MDR1,Si-MRP逆转A549/DDP细胞耐药性的体外及体内研究。方法(1)MDR1、MRP基因各设计四个干扰位点,合成SiRNA片段,分别连接质粒载体pSUPER并转染人肺癌细胞A549。48小时后,荧光显微镜观察重组质粒对A549细胞的转染效率,荧光定量PCR检测MDR1、MRP在mRNA水平上的表达,筛选出有效干扰位点用于慢病毒包装。(2)采用PTM、pHelper1.0、pHelper0慢病毒载体系统介导Si-MDR1、Si-MRP的表达。转染293T细胞得到大量重组慢病毒,转染Hela细胞进行病毒滴度测定。重组慢病毒转染宿主细胞A549、A549/DDP两天后,流式细胞仪检测转染效率、荧光定量PCR和Western Blot检测MDR1、MRP在mRNA水平和蛋白水平上的干扰效率。(3)三种化疗药物顺铂(DDP)、阿霉素(ADM)、健择(Gemzer)分别作用A549-Si-MDR1及A549/DDP-Si-MDR1细胞24小时后,荧光显微镜观察EGFP阳性细胞形态变化。(4)PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP在体外分别感染A549及A549DDP细胞(MOI=10)1周后,加入不同浓度的化疗药物:Gemzer、ADM、DDP,作用48小时后CCK-8试剂盒检测细胞凋亡情况。(5)建立PTM、PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MR稳定转染的A549及A549/DDP细胞株,在BALB/c裸鼠体内建立原位肺癌异种移植模型,给予药物后观察动物体重、肿瘤生长及多处转移情况,全面评价MDR表型。结果(1)成功设计MDR1、MRP基因的SiRNA干扰片段,并构建MDR1、MRP SiRNA筛选质粒,pSUPER-Si-MDR1、pSUPER-Si-MRP筛选有效干扰位点。(2)成功将构建的筛选质粒转染到人肺癌细胞A549及其耐顺铂细胞株A549/DDP中,转染48小时后,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白确定转染效率约47.9%。(3)采用荧光定量PCR检测转染48小时后A549细胞中MDR1、MRP在mRNA水平上的表达情况。结果显示,MDR1、MRP基因得到特异高效的沉默,证明pSUPER-Si-MDR1, pSUPER-Si-MRP质粒构建成功,是有效的SiRNA表达质粒。(4)筛选出的有效干扰位点序列用于慢病毒包装。转染293T细胞进行扩增,荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率,结果证明包装好的慢病毒载体能高效转染293T细胞,转染效率85%,并能稳定表达SiRNA。(5)重组慢病毒转染Hela细胞进行滴度测定,为5×108TU/ml。(6)PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP均以MOI=10转染A549两天后,流式细胞仪检测转染效率,PTM-Si-MDR1转染效率为77.3%,PTM-Si-MRP转染效率80.8%。(7) Real-time PCR、Western Blot检测转染两天的A549细胞MDR1、MRP在mRNA水平和蛋白水平上的表达,计算MDR1抑制效率为72%,MRP抑制效率为69%,抑制效果明显。(8)化疗药物DDP(50ug/ml)、ADM(1ug/ml)、Gemzer(200ug/ml)作用于A549-Si-MDR1细胞(转染一周)24小时后,明场及荧光显微镜下观察细胞形态,发现细胞皱缩,形态发生变化,出现凋亡现象。(9)不同浓度的DDP、ADM、Gemzer分别作用于RNAi后的细胞A549 ( A549-PTM、A549-PTM-Si-MRP、A549-PTM-Si-MDR1)和A549/DDP(A549/DDP-PTM、A549/DDP-PTM-Si-MRP、A549/DDP-PTM-Si-MDR1),48小时后CCK-8法检测细胞活性,结果显示RNAi后,A549/DDP细胞中,三组药物的Si-MRP、Si-MDR干扰组和对照组相比较,其敏感性有明显提高;A549细胞中MRP、MDR干扰组和对照组对药物的敏感性无明显差异。(10)在肺癌原位异种移植裸鼠模型体内,与PTM空载体转染的A549/DDP耐药株相比,稳定转染PTM-Si-MDR1、PTM-Si-MRP至A549/DDP耐药株,可显著降低原发肿瘤大小及对侧肺转移、远处皮下转移率,完全逆转其MDR表型。结论我们首次把慢病毒介导的RNAi技术用于人肺癌中多药耐药性基因的研究,并证明它能持久抑制人肺癌细胞A549及其耐顺铂细胞株A549/DDP中的MDR1、MRP基因表达,在细胞、基因及蛋白多个水平,通过体外和体内实验多方面证实以MDR1、MRP作为RNAi的靶基因可完全逆转A549/DDP的MDR表型。本研究为肿瘤尤其是NSCLC的临床化疗提供了实验依据和新的思路,结果提示对于继发性耐药的肿瘤病人,应用RNAi等基因治疗方法辅助化疗药物,极有可能在临床上提高缓解率、增强肿瘤细胞对药物的敏感性,延长化疗后患者的生存期。