目的:1.目前,脑皮质撞击法是一种较为常用的颅脑创伤(TBI)模型构建方法,但具体的打击参数尚无统一标准。本部分实验通过设置脑皮质撞击仪不同参数,造成TBI大鼠模型不同程度的损伤,为构建TBI模型时参数的设定提供更多参考。2.国内在颅脑创伤的基础及临床研究中不断深化,治疗效果显著提高,但仍有诸多问题亟待解决,特别是TBI后脑水肿、线粒体的功能障碍,迟发性神经元损伤等继发性损伤的防治。然而病理过程的复杂也导致了缺乏有针对性的治疗药物。尽管制药公司投资了数十亿美元用于TBI相关药物研发,但至今仍没有明确有效的药物可用于TBI急性期的治疗。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)是一种普遍存在的嘧啶核苷酸,在诸多细胞生理进程中发挥重要作用,包括细胞新陈代谢,ATP的生成,和DNA的修复。目标体温管理(TTM)治疗的方法一直延续至今,合理应用下可见其治疗效果十分可观。为此,本部分实验拟基于线粒体生物合成机制,探索NAD联合TTM对重度TBI神经功能的影响。3.颅脑创伤后往往由于开颅减压等原因会导致颅骨缺损,这既会影响美观,并造成患者心理上的焦虑与恐惧,同时也容易诱发癫痫发作。骨的同种异体移植物和自体移植物是当前治疗骨缺损的标准,然而在临床应用中会受到诸多客观条件限制。目前随着骨组织工程技术的发展,利用3D支架和自体干细胞联合完成颅骨缺损的修复已成为研究热点。本部分将利用骨组织工程技术构建丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架,并将骨髓间充质干细胞与其共培养,通过观察该细胞在支架上的增殖与分化,从而评估该复合支架应用于颅骨缺损修复的可能性。方法:1.56只大鼠按随机数字法随机等分为7组,即V1、V2、V3、D1、D2、D3和对照组,利用电子脑皮质打击仪构建不同损伤程度TBI模型,其中V组的打击最低点持续时间均为200毫秒,打击深度均为2mm,V1、V2和V3组的打击速率分别为3 m/s、4 m/s和5 m/s;D组的打击最低点持续时间均为200毫秒,打击速率均为5 m/s,D1、D2和D3组的打击深度分别为3mm、4mm、5mm。术后48小时行改良神经功能损伤评分、网屏实验评分、旷场试验评分,并测定脑组织含水量。2.将72只大鼠按随机数字法随机取12只大鼠作为对照组。剩余60只大鼠行TBI造模,使用3mm打击帽,使打击面与脑皮质表面基本平行并精确打击大鼠大脑皮层。按最低点持续时间均为200ms,4mm的打击深度,5m/s的打击速度构建重度TBI大鼠模型。在完成造模后,将60只TBI大鼠随机等分为5组,即TBI组(T group)、TBI+TTM组(T+T group)、TBI+NAD组(T+N group)、TBI+TTM+NAD组(T+T+N group)和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组(T+T+N+I group)。另外12只大鼠不进行任何处理,作为对照组(C group)。将NAD的前体-烟酰胺单核苷酸(NMN)和NAD抑制剂FK866分别溶于生理盐水中,配制成5%浓度的溶液。TBI+NAD组、TBI+TTM+NAD组和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组大鼠按照500mg/kg体质量的剂量,于造模后第二天起每日8时和18时腹腔注射NMN,连续7天,另两组TBI大鼠于同一时间注射同等剂量的生理盐水,TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组于腹腔注射NMN后1h后,腹腔注射FK866,40mg/kg。TBI+TTM组、TBI+TTM+NAD组和TBI+TTM+NAD+NAD抑制剂组在TBI后行TTM治疗,具体方法如下:将亚低温治疗仪连接后,设定冰毯温度为7℃,时程设定为6h,在TBI后10分钟,将大鼠置于冰毯上,约20分钟后肛温达到33℃-34℃后,每间隔30分钟测一次温度以保持体温维持在亚低温水平。治疗结束后,将大鼠放入室温环境以缓慢复温。于最后一次腹腔注射操作后的12h,进行行为学评分,包括网屏实验和改良神经功能损伤评分。待上述实验完成后,颈椎离断法处死大鼠,每组随机选取3只大鼠,取出脑组织并去除延髓及以下部分测脑组织含水量。每组大鼠中另取3只,切取损伤侧同一部位组织标本,分别称取重量50mg,酶联免疫吸附法检测NAD、丙二醛、肿瘤坏死因子-α。另取损伤侧同一部位脑组织约5mg并置于1.5ml无菌离心管内,提取组织DNA和总RNA。Real-time PCR法计算线粒体拷贝数,以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、PGC-1β、过氧化物酶体增生物激活受体δ(PPARδ)、核呼吸因子-1(NRF1)、NRF2、线粒体转录因子-A(TFAM)、B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)和bax基因的相对表达量。Western blot法检测S100β蛋白、水通道蛋白4(AQP4)、紧密桥接蛋白(TJPs)。免疫荧光法检测胶质细胞内受体相互作用蛋白1(RIP1)的表达情况。3.取5只SD大鼠,取出骨髓,利用全骨髓贴壁培养法分离并培养骨髓间充质干细胞。随后利用家蚕生丝制备丝素蛋白溶液,将壳聚糖和透明质酸分别溶于醋酸溶液中,制成2%壳聚糖溶液,和2%透明质酸溶液,按照丝素蛋白:壳聚糖:透明质酸=2:4:1的比例配置混合液,用磁力搅拌棒充分混匀后,将混合液移入铸模中,设置3D打印机参数,经冷冻干燥制作出固体模型。采用无水乙醇液体置换法,测量复合支架的孔隙率,应用Instron5865软件,通过绘制应力与应变相对变化曲线得出弹性模,将三维支架切割成为0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的正方体,与生长相对良好的第3代骨髓间充质干细胞细胞悬液共培养,并加入成骨诱导分化培养液,成骨诱导约7天后用扫描电子显微镜下观察支架及其中细胞生长情况。另取5块96孔板,每板使用8孔,其中在4孔内预先放入支架。取生长相对良好的第3代骨髓间充质干细胞,按照3000个/孔的密度,每孔内加入骨髓间充质干细胞细胞悬液150μl/孔,每隔日取出一板细胞,MTT法测细胞生长曲线。取诱导培养14 d后的两组细胞,茜素红染色法检测矿物结节,real-time PCR法检测骨桥蛋白、骨钙素和I型胶原等成骨相关基因表达水平的变化。结果:1.随着打击速率及打击深度的增加,神经功能损伤评分整体呈上升趋势,与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);网屏实验评分方面,除V1组外,其余各组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);D3组的网屏实验评分虽略高于D2组,但差异无统计学意义(P>0.05);D1与D2组比较,差异亦无统计学意义(P>0.05);旷场试验评分中,水平得分方面,与对照组比较,V3组以及D1至D3组得分降低,差异有统计学意义(P<0.05),而D1、D2、D3三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。垂直得分中,与对照组比较,模型组得分降低,差异均有统计学意义(P<0.05),虽然随着损伤程度的逐渐加重,得分整体呈降低趋势,但V1与V2比较,以及V2至D2组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。大便粒数方面,各组间差异均无统计学意义(P>0.05);脑含水量方面,各TBI组大鼠脑含水量随着损伤严重程度的增加,整体呈增高趋势,V2至D3组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但V3组与D1组比较差异无统计学意义,D1组与D2组比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。2.与对照组比较,TBI后各组大鼠的神经功能损伤评分均显著升高,而应用NAD及TTM后神经功能损伤评分显著降低,两者连用降低程度更为明显(P<0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的网屏实验评分均显著升高,而单独应用NAD或TTM,以及NAD与抑制剂合用后评分虽有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),NAD与TTM合用可显著降低(P<0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑含水量均显著升高;而与TBI组比较,应用NAD或TTM后,脑含水量显著降低,NAD与TTM合用后,脑含水量进一步降低,差异有统计学意义(P<0.05),腹腔注射NMN后,TBI+NAD组和TBI+TTM+NAD组大鼠脑组织中NAD含量均显著高于未注射NMN组的大鼠,差异有统计学意义(P<0.05);免疫荧光结果显示,大鼠损伤侧脑组织可见细胞质内RIP1均有表达,正常组大鼠脑组织几乎不可见RIP1阳性细胞。而与TBI组相比,应用TTM后组脑组织中RIP1阳性细胞数均能够显著降低,NAD与TTM合用组阳性细胞数降低更加明显,差异有统计学意义(P<0.05)。但单独应用NAD组与TBI组相比,差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑组织中丙二醛、肿瘤坏死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表达显著升高;而与TBI组比较,应用NAD或TTM后,S100β、AQP4蛋白表达显著降低,NAD与TTM合用后,丙二醛、肿瘤坏死因子-α、S100β、AQP4和TJPs蛋白表达进一步降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,TBI后各组大鼠的脑组织中线粒体拷贝数增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM和bax基因转录水平升高,bcl-2转录水平减低;而与TBI组比较,应用NAD后,线粒体拷贝数进一步增加,PGC-1α、PGC-1β、PPARδ、NRF1、NRF2、TFAM基因转录水平升高;NAD与TTM合用后,与单独应用TTM或NAD组及加用NAD抑制剂组相比,线粒体拷贝数进一步增加,PGC-1α、PPARδ、NRF2、TFAM和bcl-2基因转录水平升高,bax转录水平减低,差异有统计学意义(P<0.05),单独应用TTM组以及NAD抑制剂组与TBI组相比,bcl-2基因转录水平升高bax转录水平减低(P<0.05),但线粒体生物合成相关基因表达差异无统计学意义(P>0.05)。3.提取分离到的骨髓间充质干细胞浓度较大,在显微镜下,可见细胞呈圆形,胞浆较丰满,呈细沙状悬浮在培养基中。骨髓间充质干细胞在培养过程中,大约24小时即可呈现贴壁生长状态,生长较为缓慢。换液后细胞的增殖情况明显增强,出现梭形为主的多种细胞形态。12天时细胞形态较单一,多呈梭形、漩涡状和放射状排列。丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架可见支架表面较光滑,表面可见平均直径为200-250μm的孔隙,分布均匀,且相互连通,孔壁厚度约6μm。5块丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架的孔隙率测量结果为30.13±4.40%。该复合支架质地较为坚韧,浸泡PBS后略变软,形态具有延展性和可复性。复合支架压缩模量为(12.53±1.69)k Pa。扫描电子显微观察显示,复合支架呈多层立体结构,支架表面及支架内部可见附着较多骨髓间充质干细胞,呈串珠状,MTT法检测骨髓间充质干细胞的增值情况,可见培养初期细胞生长速度较为缓慢,在前3天属于生长滞缓期。从第6天起,细胞的增殖速度明显增快,提示细胞此时已经适应培养基的环境,属于指数生长期。吸光度值在细胞培养第8天时达到高峰,随即变平稳,属于细胞生长平台期,此生长曲线也较好的反映了骨髓间充质干细胞生长的周期特点,且两组细胞的增殖趋势一致,差异无统计学意义(P>0.05)。两组骨髓间充质干细胞经过成骨诱导培养2周后,用茜素红进行染色,微镜下可见橘红色沉淀,即茜素红染色阳性,表明骨髓间充质干细胞成功向成骨细胞表型进行了分化。在接种两周后,可见与复合支架共培养的骨髓间充质干细胞的骨钙素、骨桥蛋白、及I型胶原基因转录水平均显著高于正常培养的细胞,两组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:1.在固定打击最低点持续时间均为200毫秒的情况下,以2mm的打击深度,4 m/s的打击速度构建轻度TBI大鼠模型,以2mm的打击深度,5 m/s的打击速度构建中度TBI大鼠模型,以4mm的打击深度,5m/s的打击速度构建重度TBI大鼠模型,具有较好的成功率和区分度,该参数更为适合构建不同损伤程度的TBI大鼠模型。2.在重度TBI后,应用NAD可显著促进线粒体的生物合成,从而提高脑组织的能量供应,改善神经功能。TTM的应用可有效抑制细胞的凋亡,并给予受损脑组织更长的修复时间窗。两者合用可发挥相互协同作用,进一步降低炎症及氧化应激水平,降低血脑屏障通透性,减轻脑水肿,从而发挥神经保护作用,这也为日后的临床治疗TBI提供了新策略。3.本实验通过全骨髓贴壁培养法分离并培养出了骨髓间充质干细胞,实验结果提示细胞纯度较高、细胞活性较强,作为骨组织工程中的种子细胞较为适宜。通过3D打印技术构建的丝素蛋白/壳聚糖/透明质酸复合支架,具有良好的生物相容性、机械性能以及多孔性,复合骨组织工程对支架理化性质的要求,同时该支架还可上调成骨相关基因的转录,促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,这也为骨组织工程修复骨缺损提供了潜在的治疗选择,应用前景良好。