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GDF9和BMP15基因是影响绵羊高繁殖力性状的主效基因,二者均在卵巢卵母细胞中特异表达,对卵泡发育、颗粒细胞增殖和排卵均发挥重要的调控作用。目前在国外绵羊品种GDF9和BMP15基因编码区分别发现了多个与高繁殖性状相关的SNPs位点,但这些SNPs均与我国著名的高繁殖力品种湖羊无显著关联。为了进一步明确GDF9和BMP15基因与湖羊高繁殖力的关系,本研究以湖羊和巴什拜羊为研究对象,分离GDF9基因组序列、BMP15基因编码区和5’调控区序列,并分析相应序列特征;筛选2个群体中GDF9基因组序列、BMP15基因编码区和5’调控区序列SNPs位点;分析SNPs位点多态性与湖羊产羔数的关系;采用荧光素酶报告基因系统分析SNPs对启动子区的影响和机制。研究结果为探索绵羊GDF9和BMP15与绵羊繁殖性能的潜在关系,筛选影响湖羊高繁殖力性状的分子标记等提供理论依据。全文主要研究结果如下:(1)湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列特征通过PCR和测序获得了湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列,全长均为5150bp,包括5’调控区、2个外显子、1个内含子和3’调控区。在GDF9基因5’调控区预测到3个潜在的启动子区,分别位于-1129nt--1079nt、-633nt--583nt 和-270nt--220nt 处。转录因子结合位点预测发现在GDF9基因5’调控区中含有多个转录因子结合位点,如GATA4、SOX8、YY1、HSF1、AP1、OCT1、SOX1 和 PTF1 等,其中 GATA4、YY1和HSF1等已证实与卵泡发育有关。湖羊和巴什拜羊GDF9基因编码区长度均为1362bp,编码蛋白均含有453个氨基酸,与其它哺乳动物的序列一致性均较高。结构域预测发现GDF9蛋白含有典型的TGF-a结构域。M1-S32位氨基酸为GDF9蛋白可能的信号肽序列。三级结构预测发现GDF9蛋白主要由2个a-螺旋和6个a-折叠组成。在GDF9基因3’调控区预测到5处可能的miRNA结合位点,结合的miRNA包括miR-515-5p、let-7e-3p 和 let-7a-2-3p,这 3 种 miRNA 均与卵泡发育有关。(2)湖羊和巴什拜羊GDF9基因SNPs位点多态性与产羔数的关系利用DNA池测序技术,在湖羊和巴什拜羊GDF9基因组序列中发现5个SNPs位点,其中编码区1个(1599A>G,未引起氨基酸改变)、5’调控区3个(-534A>G、-407T>G和-332C>T,其中-534A>G引起转录因子OCT1结合位点改变)和3’调控区1个(2547A>G,未发现miRNA结合位点改变)。在湖羊和巴什拜羊群体中,GDF9基因启动区3个SNPs位点完全连锁,将野生单倍型A-T-C命名为A,突变单倍型G-G-T命名为B。在湖羊中和巴什拜羊群体中均检测到3种基因型(AA型、AB型和BB型),其中AA型为优势基因型(频率分别为0.6292和0.6420),A为优势等位基因(频率分别为0.7921和0.7840)。关联分析发现,AA型和AB型湖羊平均产羔数均显著高于BB型。荧光素酶活性型分析发现A型启动子区活性与B型无显著差异,而与转录因子OCT1表达载体共转后,B型启动子区活性比A型启动子区活性有极显著降低,说明-534A>G突变可能影响转录因子OCT1与之结合,进而影响启动子区活性。体外试验发现过表达OCT1后卵泡颗粒细胞凋亡率极显著升高,说明转录因子OCT1可促进卵泡颗粒细胞凋亡。(3)湖羊和巴什拜羊BMP15基因组序列特征通过PCR和测序获得湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区序列,长度均为1182 bp(二者同源性为99.92%),编码蛋白含393个氨基酸(二者同源性为100%),与其它哺乳动物的序列一致性较高。结构域预测发现BMP15蛋白含有典型的TGF-a结构域。M1-M24位氨基酸残基为BMP15蛋白可能的信号肽,三级结构预测发现BMP15蛋白主要由2个a-螺旋和6个a-折叠组成。通过PCR和测序获得1806bp湖羊和巴什拜羊BMP15基因5’调控区序列,启动子预测显示在BMP15基因-1617 nt--1568 nt处存在可能的启动子区,生物信息学分析发现在BMP15基因5’调控区中含有多个转录因子结合位点,如 HSF、CdxA、OCT-1、SRY、SOX-5、GATA-1、AP-1、NIT-2 和GATA-2等,其中HSF、OCT-1和Sp1等已证实与卵泡发育有关。(4)湖羊和巴什拜羊BMP15基因组c.-1760C>A变异与启动子区活性的关系通过DNA池测序方法在湖羊和巴什拜羊BMP15基因编码区发现1个SNP位点(6355G>A,但未引起氨基酸改变),在5’调控区发现5个突变位点(分别为-1760C>A、-1548G>A、-1146C>T、-1145G>A 和-609G>A)。BMP15 基因-1760＞A 位点多态性分析发现湖羊中均为CC型,巴什拜羊中CC、CA和AA等3种基因型的频率分别为0.6154、0.3654和0.0192。荧光素酶活性分析发现野生型(CC)启动子区活性明显高于突变型(AA),但未达到显著水平(P=0.069),说明-1760C>A位点突变对绵羊BMP15基因的启动子区活性有一定的影响。