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背景与目的肺癌是对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,在所有的恶性肿瘤中死亡率最高,我国的肺癌发生率和死亡率均居于世界首位,且呈现年轻化的趋势。化疗因其确切的疗效,仍是目前肺癌治疗的基石。通常认为化疗对免疫功能具有拮抗作用。然而,近几年越来越多的研究发现化疗一方面可以调节机体的免疫功能,另一方面能够调控肿瘤抗原的表达,进而增强机体免疫系统的抗肿瘤能力,这些研究结果都显示传统意义上的化疗药物已不仅仅是一种纯粹的具有细胞毒性的药物,学者们对其免疫调节作用的研究也愈来愈多。然而,化疗方案,药物剂量强度,肿瘤分期以及机体状况等多方面因素都能够影响化疗药的疗效,所以各个研究结论也都不尽相同。化疗是增强了肿瘤患者的细胞免疫功能还是加强了免疫抑制仍不清楚,需要进一步去探索研究。本实验主要以晚期非小细胞肺癌患者为研究对象,检测这些患者在不同化疗周期中T淋巴细胞表面的抑制性分子如细胞毒性淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)、程序性死亡分子-1(Programmed death-1 receptor,PD-1)和淋巴细胞免疫球蛋白和粘蛋白域3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3,TIM3)等的表达以及相关胞内因子如γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)颗粒霉素B(Granzyme-B,Gr-B)的分泌能力,从而综合研究化疗药对免疫系统的影响。并进一步探讨化疗药物影响机体免疫状态可能的作用机制。第一部分 探讨晚期非小细胞肺癌患者机体的免疫状态方法1)收集郑州大学第一附属医院肿瘤科于2015年6月至2015年11月初治的晚期非小细胞肺癌患者80例,入组患者在入院之前均未进行过手术,放化疗等肿瘤治疗,同时在入院的前几个月内未使用其他免疫佐剂,Karnofsky评分大于70,预计生存期大于4个月。2)收集30例健康对照由河南省红十字血液中心提供。3)肺癌患者化疗周期前在无菌条件下空腹抽取外周血6ml,收集在EDTA抗凝管中;健康人在无菌条件下空腹抽取外周血6ml,收集在EDTA抗凝管中。4)分离外周血单个核细胞,应用流式细胞技术检测外周血T淋巴细胞表面抑制性分子(CTLA-4、PD-1、TIM-3)及胞内因子(IFN-γ和Gr-B)的表达。结果1)晚期非小细胞肺癌患者与健康人相比,CD4+T淋巴细胞中,CD4+CTLA4+、CD4+PD1+、CD4+TIM3+细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01)。CD8+T淋巴细胞中,CD8+CTLA4+细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01);CD8+PD-1+、CD8+TIM3+细胞比例高于健康对照组(P<0.05)。2)流式细胞技术检测结果显示,晚期非小细胞肺癌患者外周血中,细胞表面表达PD-1的CD4+T淋巴细胞较细胞表面不表达PD-1的CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力明显下降(P<0.05);细胞表面表达CTLA-4的CD8+T淋巴细胞较细胞表面不表达CTLA-4的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-y的能力明显下降(P<0.05);细胞表面表达PD-1、TIM-3的CD8+T淋巴细胞较细胞表面不表达PD-1、TIM-3的CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力明显下降(P<0.01);细胞表面表达CTLA-4的CD8+T淋巴细胞较细胞表面不表达CTLA-4的CD8+T淋巴细胞分泌Gr-B的能力明显下降(P<0.05)。小结晚期非小细胞肺癌患者与健康人相比,外周血T淋巴细胞表面抑制性分子的表达明显升高,且这些抑制性分子的表达降低了 T淋巴细胞分泌IFN-y和Gr-B的功能,提示晚期非小细胞肺癌患者机体处于免疫抑制状态。第二部分 探讨化疗后晚期非小细胞肺癌患者机体免疫状态的变化方法1)收集郑州大学第一附属医院肿瘤科于2015年6月至2015年11月初治的晚期非小细胞肺癌患者80例,入组患者化疗方案采用顺铂(75mg/m2)联合多西他赛(30mg/m2,在第1天和第8天),3周一个周期,所有患者治疗4个周期。2)入组患者每2周期进行一次CT、MRI及肿瘤标志物的复查,参照世界卫生组织(WHO)所颁布的有关实体瘤化学治疗的疗效准标,将患者分为病情部分缓解/稳定组及病情进展组。3)患者在每次化疗周期前在无菌条件下空腹抽取外周血6ml,收集在EDTA抗凝管中。分离外周血单个核细胞。应用流式细胞技术检测检测外周血中T淋巴细胞表面抑制性分子(CTLA-4、PD-1、TIM-3)及胞内因子(IFN-γ、Gr-B)的表达。4)分析病情部分缓解/稳定组及病情进展组患者的各项结果,并对结果进行统计分析。结果1)化疗后疗效评价为疾病部分缓解/稳定组的患者检测结果显示:化疗第二周期开始,CD4+T、CD8+T淋巴细胞表面PD-1分子的表达呈现明显下降趋势(P<0.05;P<0.01),第四个周期时这种下降的趋势不再显著。化疗第一周期开始,CD4+T淋巴细胞表面TIM-3分子的表达呈现明显下降趋势(P<0.01),第三个周期开始,CD8+T淋巴细胞表面TIM-3分子的表达呈现明显下降趋势(P<0.01)。2)化疗后疗效评价为疾病进展组的患者检测结果显示:随着化疗周期的进行,患者外周血中T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1、TIM-3等抑制性分子的表达比例均无明显变化(P>0.05)。3)连续化疗四个周期后,疗效评价为疾病部分缓解/稳定组患者外周血中第二周期开始,肺癌患者外周血中T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力明显升高(P<0.05)。而分泌Gr-B的能力无明显变化(P>0.05)。小结化疗后疾病部分缓解/稳定组患者,机体T淋巴细胞表面抑制性分子明显下降,分泌IFN-γ的能力增强,机体的免疫抑制状态得到一定程度的解除,而疾病进展患者,T淋巴细胞表面抑制性分子无明显变化。第三部分体外观察多西他赛对晚期非小细胞肺癌患者外周血T淋巴细胞表面PD-1分子的影响方法1)磁分选晚期非小细胞肺癌患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞,并采用流式细胞技术检测其纯度。2)检测多西他赛对分选后的CD4+T、CD8+T淋巴细胞表面抑制性分子(CTLA-4、PD-1、TIM-3)及胞内因子(IFN-γ)的影响,并对结果进行统计分析。3)检测多西他赛对CD4+T、CD8+T淋巴细胞凋亡的影响。结果1)通过磁分选获得晚期非小细胞肺癌患者外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞,分为对照组和处理组,分别于加入多西他赛24小时及48小时后检测各组细胞表面分子变化,发现药物处理24小时对细胞表面抑制性分子的影响较大,故选取24小时为体外药物处理结束时间。流式细胞技术检测结果显示:多西他赛处理24小时后,CD4+T、CD8+T淋巴细胞表面CTLA-4、PD-1、TIM-3等抑制性分子的表达水平均有不同程度的下降,其中CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T淋巴细胞表达水平与未加药组明显下降(P<0.05)。多西他赛处理24小时后,CD4+T、CD8+T淋巴细胞分泌IFN-y的能力明显升高(P<0.05)。2)通过凋亡实验发现多西他赛对CD4+PD-1+T、CD8+PD-1+T淋巴细胞和CD4+PD-1-T、CD8+PD-1-T淋巴细胞凋亡的影响无明显差异(P>0.05)。说明多西他赛能够降低T淋巴细胞表面PD-1分子的表达。小结化疗能够降低T淋巴细胞表面PD-1分子的表达,对T淋巴细胞的功能具有一定的优化作用,能活化抗肿瘤免疫应答,增强机体的抗肿瘤反应。第四部分多西他赛抑制T淋巴细胞表面PD-1分子表达的机制方法1)检测Jurkat T细胞株表面PD-1分子的表达。2)检测多西他赛对Jurkat T细胞株表面PD-1分子的影响及对Jurkat T细胞p-STAT3水平的影响以及细胞凋亡的影响。Jurkat T细胞分为空Jurkat组、Jurkat刺激组、Jurkat刺激加多西他赛组。刺激组加入PMA、离子霉素各1ul,Jurkat刺激加多西他赛组加入PMA、离子霉素各1ul及多西他赛(终浓度为1ug/ml),对照组加入同体积的生理盐水。处理24小时后流式细胞技术检测上述指标。3)细胞总蛋白提取将Jurkat T分为空Jurkat组、p-STAT3抑制剂组、多西他赛组、p-STAT3抑制剂加多西他赛组(STAT3抑制剂早于多西他赛半小时加入培养体系)。各组分别处理24小时后,收集细胞,提取细胞总蛋白,-80℃保存备用。4)Western blot 了解各组细胞p-STAT3及STAT3的含量表达。结果1)经过PMA、离子霉素刺激后的Jurkat T细胞表面PD-1分子的表达比例由0.3%升至3%左右。2)Jurkat T细胞分为空白组、刺激组、多西他赛加刺激组,采用流式细胞技术检测各组之间凋亡无明显差异(P>0.05),因此我们选用JurkatT细胞株为研究对象,研究多西他赛对PD-1分子的影响机制。3)JurkatT细胞分为空白组、STAT3阻断剂组、多西他赛组、多西他赛加STAT3阻断剂组,采用流式细胞技术检测各组细胞之间表面PD-1分子的表达。结果显示:多西他赛组与空白组相比,PD-1分子的表达明显下降(P<0.05),而同时加入多西他赛与STAT3抑制剂组同多西他赛组相比,PD-1分子水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),多西他赛能够显著升高JurkatT细胞的p-STAT3的水平(P<0.05)。4)采用Westenblot的方法从蛋白水平对多西他赛的这种作用进行验证,结果显示多西他赛能够升高Jurkat T细胞的p-STAT3的水平。小结多西他赛可以通过上调T淋巴细胞的磷酸化的STAT3水平来降低T淋巴细胞表面抑制性分子PD-1的表达,进而使耗竭的T淋巴细胞恢复功能。