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目的:对基于二代测序（Next generation sequencing,NGS）平台构建的MultipSeq?AI-Y-STR-Multi试剂盒进行法医学验证,评估其在法医遗传学中的应用价值,为构建具有更高系统效能的Y染色体短串联重复序列（Y chromosome short tandem repeat,Y-STR）检测系统提供基础数据和技术支持。方法:根据中国司法行政行业标准“染色体遗传标记高通量测序与法医学应用规范”（SF/T 0070—2020）和美国DNA分析方法科学工作组（Scientific Working Group on DNA Analysis Methods,SWGDAM）对试剂盒验证的具体要求,并基于Illumina MiSeq FGxTM测序平台,对 MultipSeq?AI-Y-STR-Multi 试剂盒中包含的20个Y-STR基因座进行一致性、灵敏度、重现性与重复性、特异性、抗干扰能力、混合样本等研究;同时应用Goldeneye? Y-Plus试剂盒进行毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）平行检测。结果:1.一致性:通过检测获得51份男性DNA样本的NGS分型及其序列信息,并与CE分型结果进行一致性比对。结果显示:在51份男性DNA样本中,共检出1020个等位基因序列,NGS与CE分型一致率为100%。2.灵敏度:当 DNA 模板量分别为 4 ng、2 ng、1ng、500 pg、250 pg、125 pg时,NGS等位基因检出率均为100%。当模板量分别为62.5 pg、31.25 pg以及15.625 pg时,NGS等位基因检出率分别为90%、70%和60%。3.重现性与重复性:在不同实验人员以及不同实验仪器上,对9948男性标准品DNA样本进行三次重复测试,NGS分型结果完全相同。4.特异性:在种属特异性研究中,猴子样本只在6个基因座（DYS385b、DYS393、DYS437、DYS481、DYS635 和 Y-GATA-H4）上观察到有效的等位基因分型结果（深度>100×）,且极易与人类男性DNA样本区分开。检测体系具有男性特异性,在女性样本中没有扩增产物。5.干扰物研究:研究中设置的5种常见PCR抑制物分别为腐殖酸、尿素、黑色素、靛蓝以及血红蛋白。尿素浓度为500 ng/μL时对结果无影响,12 ng/μL以下浓度的黑色素对结果影响有限,血红蛋白浓度小于10 μM时完全一致,腐殖酸浓度为10 ng/μL时不影响结果。靛蓝在浓度为8 μM时对检测结果有一定的影响。结果表明,20Y-STR检测系统具有足够的抗干扰能力,可用于法医遗传鉴定。6.混合样本检测:研究中分别测试了该体系在男/女、男/男混合物中的表现。在男/女混合物的研究中,当存在过量女性DNA（400 ng）时,该试剂盒仍可以选择性地扩增其中的男性 DNA（250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg 和 15.625 pg）。当男性DNA模板量为125 pg时,等位基因检出率可达到100%。随着男性DNA模板量分别减少至62.5 pg、31.25 pg和15.625 pg时,检出率分别降低至90%,85%以及70%。此外,研究测试了试剂盒在男/男混合物中检测次要贡献者基因型的能力。混合比例为49:1、19:1、9:1、3:1、1:1,结果显示仅在1:1的混合比例下,能够在所有基因座上同时检测到两个DNA样本的等位基因。结论:本研究对基于NGS技术构建的MultipSeq?AI-Y-STR-Multi试剂盒进行了法医学性能验证。尽管试剂盒在男/男混合样本检测方面的能力欠佳,仍需要进一步优化,但该检测体系具有较高的灵敏度、良好的重现性与重复性,以及较强的抗干扰能力,可用于Y-STR基因座的初步检测、男/女混合样本的检测,满足法医遗传学实际应用的需要。