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研究背景随着精准医学研究的进展,人类疾病展现了相互关联的观景:疾病状态因临床表型不同而有所区别,但不同疾病又可能是由相同靶标功能失调引起,现代医学进入辨病治疗与辨“靶点”治疗相结合的时代。研究疾病之间的关系在新药研发和药物重定位中起着重要作用。目前,心血管病死亡仍占我国城乡居民总死亡原因的首位,社会负担沉重。其中,缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy,ICM）是心力衰竭的主要原因,每年约1800万人死于该病,占所有死亡人数的31%,中西医均缺乏具有针对性的药物治疗。而在疾病关联中,稳定性心绞痛（stable angina pectoris,SAP）和ICM均属于稳定性冠心病（stable coronary artery disease,SCAD）范畴,且在病理机制上存在疾病进展的关系,因此通过研究疾病之间的关系探寻针对于缺血性心肌病的有效药物具有重要的临床价值。研究目的本研究基于疾病进展模块对探索稳定性心绞痛、缺血性心肌病和慢性心力衰竭的疾病间内在关联机制,筛选治疗缺血性心肌病的核心处方,通过药效学实验及蛋白质组学技术评价处方的临床前疗效及效应机制,进而利用RT-qPCR技术验证疾病间关系的靶点,探索基于同靶点同通路的广谱抗缺血药物研发路径的可行性。研究方法1疾病间关系探索通过整合多个数据库的数据,基于模块重构对的K值的计算（一种整合模块拓扑参数及其权重的欧氏距离优化方法）方法,构建疾病进展模块对（paired disease progression module,PDPM）,识别 SAP、ICM 和慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）之间的关系。最后,通过功能富集分析和文献验证来探讨三种疾病在疾病进展中的关系。2缺血性心肌病核心处方筛选基于课题组前期已知的有效药物（丹红注射液）治疗稳定性心绞痛的全基因组测序数据,利用基因共表达网络和模块药理学方法发现冠心病（缺血性心肌病）的有效治疗靶点（多靶点模块）,基于靶点模块筛选缺血性心肌病潜在的中药治疗处方。3处方药效学实验研究选取检疫合格的Beagle犬46只,雄性,体重7.58～13.91kg,按性别体重随机分为两组,正常组6只,模型对照组40只。模型对照组动物结扎冠状动脉左前降支,复制缺血性心肌病模型。取模型成功的动物36只,按拉丁方分为模型组、通脉颗粒组,葛石通脉颗粒颗粒低、中、高剂量组以及消心痛组,每组6只动物。各给药组按5mL/kg灌胃给予相应药物,正常组和模型组灌胃给予等体积纯水,每天1次,连续给药8周。给药期间每周监测Beagle犬体重。于给药前和给药第6、8周进行心电图检测和心功能相关指标检测,包括心率、心输出量（CO）、舒张末期左心室容积（LVEDV）、左心室舒张末压（LVEDP）、收缩末期左心室容积（LVESV）、舒张末期左心室内径（LVIDD）、舒张末期左心室壁厚度（LVPWD）、收缩末期左心室内径（LVIDS）、收缩末期左心室壁厚度（LVPWS）、射血分数（EF）,于末次给药当天进行血清脑钠肽（BNP）及和肽素（CPP）含量检测;于末次给药后次日将每组动物安乐死后取心脏,称重、计算脏器系数,并进行HE染色和Masson染色,光学显微镜观察心肌细胞、心肌间质组织结构、心肌纤维化水平等。4疗效机制及疾病间关系靶点验证末次给药后次日取出7组42只Beagle犬左心室心肌组织,采用DIA蛋白质组学技术来筛选差异蛋白并对差异蛋白进行功能富集分析,以探索处方疗效的分子机制。根据心肌组织的样品量,每组选取5只犬进行疾病进展模块对中靶点的RT-qPCR验证,并将已验证靶点与疗效的差异蛋白在通路上相互作用进行分析。研究结果:1.SAP、ICM 和 CHF 疾病间关系:SAP、ICM 和 CHF 间共 16 对 PDPMs（K＞0.3777）,其中SAP-ICM阶段为6对,ICM-CHF和SAP-CHF阶段各5对。针对SAP-ICM和ICM-CHF两个阶段,SAP-ICM阶段共计27个独有基因,其中ICM模块5和7是独有模块（包括ADAMTS9和NPPA基因）,27个基因涉及炎症、血管生成、纤维化、细胞自噬和钙稳态等方面,影响AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、HIF-1信号通路等9条通路;ICM-CHF阶段共计4个独有基因,ICM模块6和9是独有的模块（包括STAT1、ADORA1和APLN基因）,均涉及炎症;SAP-ICM-CHF共计11个重叠基因,其中ICM中1和8模块是共有模块,涉及其中的5个基因（AGT,REN,CDH5、PGF、FLT1）,重叠11个基因主要涉及血压、炎症、血管生成和电解质功能,影响肾素-血管紧张素系统、Rap1信号通路,美洲锥虫病、癌症通路等4通路。2.缺血性心肌病核心处方筛选:以Zsummary＜0为标准筛选丹红注射液治疗稳定性心绞痛后的差异模块:丹红注射液治疗全部病例组数据筛选出1个差异模块,其中7个模块相关基因匹配到3个中药相关化学成分;丹红注射液有效病例组数据筛选出2个差异模块,其中DHsub-black模块3个基因匹配到2个中药相关化学成分,DHsub-brown模块10个基因匹配到8个化学成分。最终,经过中药筛选及组方理论,获得缺血性心肌病的处方为葛石通脉方（组成:葛根,石韦,银杏叶,木贼,虎杖,鸡骨草,紫苏梗）3.处方药效学实验研究①对ST段影响:给药第8周,与模型对照组比较,通脉颗粒组、葛石通脉颗粒低、中、高剂量组和消心痛组动物均显著降低（P＜0.05）。②对心功能的影响:给药6周,与模型对照组比较,葛石通脉颗粒中、高剂量组和消心痛组CO均显著升高（P＜0.05）,通脉颗粒组、葛石通脉颗粒低、中、高剂量组EF均显著升高（P＜0.05）,葛石通脉颗粒低剂量组LVPWS和LVPWD均显著升高（P＜0.01）、LVESV和LVIDD均显著降低（P＜0.05）。与通脉颗粒组比较,葛石通脉颗粒中剂量组CO显著升高（P＜0.05）。给药第8周,与模型对照组比较,葛石通脉颗粒中、高剂量组和消心痛组EF均显著升高（P＜0.05）,通脉颗粒组、葛石通脉颗粒低、中、高剂量组和消心痛组LVESV和LVIDS均显著降低（P＜0.05）,葛石通脉颗粒中、高剂量组LVPWS均显著升高（P＜0.05）。与通脉颗粒组比较,消心痛组心率显著降低（P＜0.01）。③对BNP和CPP的影响:与模型对照组比较,通脉颗粒组、葛石通脉颗粒低、中、高剂量组和消心痛组BNP和CPP均显著降低（P＜0.01）。与通脉颗粒组比较,葛石通脉颗粒低剂量组CPP显著升高（P＜0.05）。④对心肌组织病理学:与模型对照组比较,通脉颗粒组、葛石通脉颗粒中、高剂量组和消心痛组动物心脏脏器系数均显著减小（P＜0.05）。HE染色和Masson染色结果显示与模型对照组比较,葛石通脉颗粒高剂量组和消心痛组心脏病变范围及程度明显减轻。病理分级结果显示与模型对照组比较,葛石通脉颗粒高剂量组和消心痛组心肌炎症浸润程度和心肌组织纤维化程度明显减轻（P＜0.05）。4.疗效机制研究:以低剂量组为对照,正常组、模型组、通脉颗粒组、消心痛组有5个重叠差异蛋白,分别是COL14A1、ATG9A、MYOM1、PDIA5、OAT。以中剂量组为对照,发现4个重叠差异蛋白,分别是KRT2、PPP1R13B、HNRNPUL1、ANKFY1。以高剂量组为对照,发现9个重叠差异蛋白,分别是PAFAH1B2、RO60、OXSR1、PPP1R12C、ME3、MRPS18B、PAFAH1B3、COPS6、F1PYE8。各剂量组之间比较有一个重叠差异蛋白TGFB1I1。构建PPI网络可见OAT、PPP1R12C、TGFB1I1分别是以低剂量组为对照、以高剂量组对照、以及各剂量组间的重叠差异蛋白。与模型组比较,低剂量组差异蛋白主要影响人巨细胞病毒感染和人乳头瘤病毒感染通路,中剂量组差异蛋白主要影响催产素信号通路,高剂量组差异蛋白主要影响血管平滑肌收缩通路,其中血管平滑肌收缩通路是以高剂量组为对照,正常组、模型组、通脉颗粒组、消心痛组差异蛋白富集的共同通路。与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组的差异蛋白主要涉及到粘着斑通路,与中剂量组比较,高剂量组差异蛋白涉及剪接体通路。5.PDPMs的靶点验证:通过RT-qPCR验证PDPMs的靶点,发现与模型组比较,AGT、NPPA基因的表达量在葛石通脉低剂量组、高剂量组以及消心痛组均有上升趋势,AGT基因的表达量在葛石通脉中剂量组也有上升趋势,且均有统计学意义（P＜0.05）,与正常组比较,AGT、NPPA基因的表达量在葛石通脉低剂量组、中剂量组、高剂量组及消心痛组均呈上升趋势,且有统计学意义（P＜0.05）,ADORA1基因表达在模型组、和低剂量组均有上升趋势,且有统计学意义（P＜0.05）。已验证到基因（AGT、NPPA、ADORA1）涉及肾素-血管紧张素系统,并且这3个基因与差异蛋白PPP1R12C影响血管平滑肌收缩通路和催产素信号通路。低剂量组vs模型组差异蛋白富集的通路与SAP-ICM阶段有4条通路重叠,占SAP-ICM阶段总通路的66.67%（4/6）,分别是疟疾信号通路、松弛素信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染通路、人类乳头瘤病毒感染通路。低剂量组vs模型组差异蛋白富集的通路与SAP-ICM-CHF有2条通路重叠,达到50%（2/4）分别是Rap1信号通路和癌症信号通路。与模型组比较,各剂量组重叠的差异蛋白与SAP-ICM阶段基因有11.11%（3/27）的重叠率,重叠基因分别是ICAM1、FN1、TIMP1,与ICM-CHF阶段基因有16.67%（1/6）的重叠率,重叠基因是STAT1,与SAP-ICM-CHF阶段有36.36%（4/11）重叠率,重叠基因分别是AGT、FLT1、CRP、CDH5。研究结论1.利用PDPM方法,我们发现炎症是三个疾病不同阶段基因均涉及的因素,其中SAP-ICM-CHF的基因还涉及血管生成、血压和电解质,主要影响通路为肾素-血管紧张素系统。而SAP-ICM阶段中的基因除炎症和血管生成外还涉及纤维化、细胞自噬和钙稳态等功能,主要影响通路为AGE-RAGE信号通路。2.葛石通脉颗粒能显著降低缺血性心肌病Beagle犬心电图中ST段,改善心功能及心肌组织纤维化程度;同时,低剂量为起效剂量,高剂量效果最佳,中剂量药效效果与阳性药通脉颗粒相当。3.葛石通脉颗粒低剂量组差异蛋白主要影响人巨细胞病毒感染和人乳头瘤病毒感染通路;中剂量组差异蛋白主要影响催产素信号通路;高剂量组差异蛋白主要影响血管平滑肌收缩通路,此通路也是以高剂量为对照,各组差异蛋白富集的共同通路。与低剂量组比较,中剂量组和高剂量组差异蛋白主要涉及到粘着斑通路,与中剂量组比较,高剂量组差异蛋白涉及剪接体通路。4.通过基因与通路的覆盖率以及RT-qPCR的验证,葛石通脉颗粒可以作用于SAP、ICM、CHF各个阶段的多个靶点及通路,对三个具有缺血病理性质的疾病起作用。提示探索基于同靶点同通路的广谱抗缺血药物研发路径的可行性,也为中医药“异病同治”的科学内涵提供一种思考。