广西猪戊型肝炎分子流行病学调查及戊型肝炎病毒ORF2的扩增和抗原性分析

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戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的消化道病毒性肝炎。大量的报道已经证实,HE在国内外均非常的盛行,人和多种动物对HEV均易感。广西为我国养猪大省,但对于猪群HE的调查及HEV的抗原性研究仍处于起步阶段,因此弄清广西猪戊型肝炎的流行状况、猪源HEV与人源HEV在基因水平上的差异、HEV抗原表位的分布及抗原性基因的特征,对于戊型肝炎的防治、疫苗的研发都具有重大的意义。   研究一,本研究通过RT-nested-PCR的方法对2009年07月至2010年03月从广西6个市县13个不同规模猪场采集的135份新鲜猪粪进行检测。结果显示135样品中有38份为HEV RNA阳性,阳性率为28.1%。在调查的13个猪场中,仅有一个猪场未检测到HEV RNA,猪场阳性率为92.3%。各猪场样品检出率在0-44.4%之间,13各猪场中有8个猪场感染率处于30-45%之间。   对13个猪场中各种年龄样品均能采集到的6个猪场的猪群进行感染率调查,67份不同月龄的样品中,0-30日龄HEV RNA阳性率为0%;31-60日龄阳性率为7.7%;61-90日龄HEV RNA阳性率为40%;91-120日龄HEVRNA阳性率最高,为58.8%;当猪群年龄超过120日龄后HEV RNA阳性率逐渐降低,阳性率为30.8%。结果显示2-4月龄为猪群的感染高峰期,32份样品中有16份样品为HEV RNA阳性,阳性率为50%。   随机对24份阳性样品进行克隆,去除4份同源性为100%的分离株后得到20株同源性不一致的毒株。20株分离株间核苷酸同源性为91.2-99.7%。与基因型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅱi型、Ⅳ型及禽HEV参考序列核苷酸同源性分别为:78.6-83.4%,75.9-77.9%,75.3-81.4%,83.4-97.7%,55.6-58.9%。20株分离株间氨基酸同源性为97.7-100%,其中13株氨基酸同源性为100%。与基因型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型及禽HEV参考株氨基酸同源性分别为:92.4-95.5%,93.1-93.9%,94.7-97%,97.7-100%,55.6-56.5%。   通过用MEGA4.1软件Neighbor-Joining中的P-距离法对20株分离株及各基因型参考株进行进化树构建与分析,结果显示所有的分离株均属于基因型Ⅳ型。在所有Ⅳ型序列中又可以分为6个亚型,本研究所有的分离株都分布在亚型b中。   研究二,参考中国T1株序列设计巢式引物,从新鲜猪粪中扩增HEV部分基因片段,长为1725bp,位于HEV ORF2205-1929bp之间,命名为HEVORF2-A。其后根据HEVORF2-A序列设计三对引物分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段,命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3,分别位于HEVORF2-A1-576bp,577-1149bp,1150-1725bp之间。将四段扩增的基因片段分别与表达载体PET32a(+)连接,转入BL21(DE3)plysS感受态细胞,IPTG进行蛋白诱导。经1mmol/L的IPTG在37℃诱导6小时后,除PET32a-A在82.6kd处有微量融合蛋白表达外,PET32a-B1,PET32a-B2,PET32a-B3分别在41.3kd、41.5kd、41.8kd处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和万泰HEV ELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行western-blot检测,三个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明本研究所构建的三个表达载体具有良好的抗原性。
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