研究背景:宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,仅次于乳腺癌;在我国宫颈癌的发病率近十年来逐渐上升,并趋于年轻化。尽管在发达国家,随着人们对宫颈癌致病因素和自然病程认识的深入,通过适宜的筛查技术及全面体查,宫颈癌的发病率和死亡率已明显下降。然而在多数发展中国家,宫颈癌的发病率及死亡率仍居高不下,在我国宫颈癌的每年新发病例数约在13万以上,其中死亡患者至少2～3万例。而宫颈上皮内瘤变属于宫颈的癌前病变,与宫颈癌的发生密切相关。因此,研究与宫颈癌发生及发展相关的分子标志物,有利于阐明宫颈癌的发病机制,也有利于宫颈癌的早期诊断、治疗及预后评估。PBK/TOPK(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase)是一种新型的蛋白激酶,最早于淋巴因子激活的杀伤性T细胞(T-LAK)中发现,与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关。PBK/TOPK在多种恶性肿瘤中呈高表达,而在多种正常组织中均难以检测到其表达。PBK/TOPK表达是否参与了宫颈癌的发生及发展过程,目前尚无研究报道。P16是一种新型的抑癌基因,在许多种恶性肿瘤中发生缺失、突变,参与多种肿瘤的发生及发展过程。Ki-67是一种常见的细胞增殖检测标记物,广泛应用于临床病理诊断中。P53是一种抑癌基因,其表达的缺失或突变与多种肿瘤的发生及发展密切相关。目前,部分研究报道表明P16、Ki-67及P53均与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的发生有关。然而P16、Ki-67及P53在宫颈上皮内瘤变及宫颈癌中的作用关系是否与PBK/TOPK有关,目前尚不清楚,为此我们开展了本研究。研究目的及内容:1.探讨PBK/TOPK在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达及其预后意义;2.探讨PBK/TOPK与P16、Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及其预后意义;3.探讨P16与Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及其预后意义;4.探讨Ki-67与P53在宫颈病变中的表达及其意义;材料及方法:1.PBK/TOPK在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达及其预后意义分析免疫组化法检测28例CIN I组织,62例高级别上皮内瘤变组织及80例宫颈癌组织中PBK/TOPK的表达;用计算机ImageproPlus6.0(IPP)图像分析软件定量测试PBK/TOPK表达的阳性单位(PU值),同时采用半定量分析法结合临床相关病理资料及随访资料进行统计学分析及术后生存分析。2.PBK/TOPK与P16、Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及预后意义分析免疫组化法检测80例宫颈癌组织中PBK/TOPK、P16、Ki-67及P53的表达,采用定量及半定量方法对免疫组化结果进行分析,探讨PBK/TOPK与P16、Ki-67及P53表达的相关性,结合临床相关病理资料及随访资料进行术后生存分析。3.P16与Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及预后意义分析免疫组化法检测80例宫颈癌组织中P16与Ki-67及P53的表达,采用定量及半定量方法对免疫组化结果进行分析,探讨P16与Ki-67及P53表达的相关性,结合临床相关病理资料及随访资料进行术后生存分析。4.Ki-67与P53在宫颈病变中的表达及其意义分析免疫组化SP法检测7例宫颈炎活检组织,38例CINI组织,79例高级别上皮内瘤变组织及91例宫颈癌组织中Ki-67及P53的表达,探讨其表达与宫颈病变的关系,同时探讨Ki-67及P53表达的相关性及预后意义。半定量判定参考标准:结合PBK/TOPK、P16、Ki-67及P53表达的显色强度及阳性表达细胞的百分比进行评定。显色强度评分范围为0～3分,其中:0分:无色;1分:淡黄色;2分:棕黄色;3分:棕褐色;阳性细胞百分比评分范围为1～4分,其中:1分:0%-10%;2分:11%-24%;3分:25%-50%;4分:>50%,两项得分乘积大于等于6分记为高表达,小于6分记为低表达。定量结果判断:依据阴性对照组和阳性对照组的显色情况,在确定无假阳性和假阴性的前提下,以肿瘤细胞胞浆或胞核染成棕黄色或棕褐色为阳性。采用ImagePro Plus图像分析软件,测试各例样本的阳性单位值(Positive Unit,PU)[7-9]。操作如下:在40×物镜下从每例切片中取10个着色最强的视野,将其转换成灰度图像。利用ImagePro Plus图像分析软件测试每个视野下肿瘤细胞或正常宫颈上皮细胞表达的灰度值Gα,同时测试其背景灰度值Gβ,均取其均值,按下列公式:PU=|Gα-Gβ|/Gmax×100测算每一显色反应视野的阳性单位(PU值),取其均值作为该组织切片的PU值,本研究中测试软件的Gmax的最大灰度分级设定为256。5.统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析。两样本均数间的比较采用独立样本t检验,多样本均数间的比较采用单因素方差分析。采用Spearman秩相关进行相关性分析。术后总体生存率的比较采用Pearsonχ2检验,利用Kaplan-Meier法log rank检验进行单因素生存分析,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型。双侧检验P<0.05具有统计学意义。结果:1..PBK/TOPK在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变组织中的表达及其意义PBK/TOPK阳性单位(PU)的定量检测结果表明PBK/TOPK在宫颈癌组织中的表达明显高于高级别上皮内瘤变及CINI组织,差异均具有统计学意义(P=0.000,P=0.000);PBK/TOPK在高级别上皮内瘤变组织中的表达也明显高于CINI组织,差异具有统计学意义(P=0.000);PBK/TOPK在宫颈癌组织中的表达与组织学类型、分化程度、淋巴结转移、阴道及宫颈受累、分期及肿瘤大小有关(P<0.05),而与年龄无明显相关(P>0.05)。PBK/TOPK高表达患者的3年及5年的总体生存率分别为88.3%、74.1%,低表达患者预后的3年及5年的总体生存率为100%、75.0%,差异无明显统计学意义(P>0.05)。Kaplan-Meier单因素及Cox比例风险回归模型生存分析法表明淋巴结转移与宫颈癌患者的预后明显相关(P<0.05),而PBK/TOPK表达、年龄、分化程度、阴道及宫颈受累、TNM分期及肿瘤大小与宫颈癌患者预后无明显相关。2.PBK/TOPK与P16、Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及预后意义分析定量检测PBK/TOPK及P16在宫颈癌组织中表达,结果显示PBK/TOPK与P16表达呈显著正相关关系(r=0.375,P=0.000)。同时,半定量分析结果显示PBK/TOPK与P16在宫颈癌中的高表达率分别为75.0%、81.3%,差异有统计学意义(P=0.000),二者表达也存在着明显的正相关关系(r=0.684,P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果表明PBK/TOPK低/P16低、PBK/TOPK低/P16高、PBK/TOPK高/P16低、PBK/TOPK高/P16高四组患者的预后生存时间组内比较具有明显统计学意义(P=0.000),PBK/TOPK高/P16低患者预后不良。定量分析PBK/TOPK与Ki-67的表达,结果表明二者表达呈显著正相关关系(r=0.407,P=0.000)。半定量分析结果示PBK/TOPK与Ki-67在宫颈癌中的高表达率分别为75.0%、72.5%,差异无统计学意义(χ2=0.129,P=0.858),但PBK/TOPK与P16表达存在着明显的正相关关系(r=0.555,P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果表明PBK/TOPK低/Ki-67低、PBK/TOPK低/Ki-67高、PBK/TOPK高/Ki-67低、PBK/TOPK高/Ki-67高四组患者的预后生存时间组内比较无明显统计学意义(χ2=3.178,P=0.365)。定量分析PBK/TOPK与P53在宫颈癌组织中表达,结果显示二者表达呈显著正相关关系(r=0.351,P=0.001)。半定量分析结果示PBK/TOPK与P53在宫颈癌中的高表达率分别为75.0%、42.5%,差异有统计学意义(χ2=17.434,P=0.000),二者表达存在着明显的正相关关系(r=0.38,P=0.001)。Kaplan-Meier单因素生存分析,结果表明PBK/TOPK低/P53低、PBK/TOPK低/P53高、PBK/TOPK高/P53低及PBK/TOPK高/P53高四组组内比较差异无明显统计学意义(χ2=6.612,P=0.085)。3.P16与Ki-67及P53在宫颈癌组织中表达的相关性及预后意义分析定量分析P16及Ki-67在宫颈癌组织中的表达,结果显示P16与Ki-67表达呈显著正相关关系(r=0.487,P=0.000)。半定量分析结果示P16与Ki-67在宫颈癌中的高表达率分别为81.3%、72.5%,差异无明显统计学意义(χ2=1.723,P=0.26),二者表达存在着明显的正相关关系(r=0.637,P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析表明P16表达与宫颈癌患者预后的生存时间并无明显相关(P>0.05),而 P16 低/Ki-67 低、P16 低/Ki-67 高、P16 高/Ki-67 低、P16高/Ki-67高四组组内比较差异具有明显统计学意义(χ2=38.67,P=0.000),P16低/Ki-67高患者预后不良。定量分析P16与P53在宫颈癌中的表达,结果显示二者表达呈显著正相关关系(r=0.482,P=0.000)。半定量分析结果显示P16与P53在宫颈癌中的高表达率分别为81.3%、42.5%,差异有明显统计学意义(χ2=10.620,P=0.002),二者表达存在着明显的正相关关系(r=0.413,P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析,结果表明P16低/P53低、P16低/P53高、P16高/P53低、P16高/P53高四组组内比较差异具有明显统计学意义(χ2=37.708,P=0.000),P16低/P53高患者预后不良。4.Ki-67与P53在宫颈病变中的表达及其意义分析定量检测结果表明Ki-67在高级别上皮内瘤变组织及宫颈癌组织中的表达明显高于CINI及宫颈炎组织中的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。P53在高级别上皮内瘤变组织及宫颈癌组织中的表达明显高于CIN I及宫颈炎组织中的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。定量检测结果显示Ki-67及P53在宫颈癌中的表达呈明显正相关关系(r=0.577,P=0.000)。同时,半定量分析结果显示Ki-67及P53在宫颈癌组织中的高表达率分别为75.8%,41.8%,二者差异具有明显统计学意义(χ2=21.795,P=0.000),二者表达也呈明显的正相关关系(r=0.322,P=0.002)。Kaplan-Meier生存分析表明Ki-67及P53表达与宫颈癌患者的预后生存时间无明显相关(χ2=0.499,P=0.480;χ2=3.288,P=0.07)。将Ki-67与P53进行两两结合,Ki-67低/P53低、Ki-67低/P53高、Ki-67高/P53低及Ki-67高/P53高四组组内比较,差异均不明显,无统计学意义(χ2=3.35,P=0.341)。结论:1.PBK/TOPK表达与宫颈上皮内瘤变的进展、宫颈癌的发生及发展密切相关;2.PBK/TOPK在宫颈癌组织中的表达与P16、Ki-67及P53相关,PBK/TOPK高/P16低患者预后不良;3.P16在宫颈癌组织,中的表达与Ki-67及P53呈正相关,P16低/Ki-67高及P16低/P53高患者预后不良;4.Ki-67及P53表达与宫颈上皮内瘤变的进展、宫颈癌的发生及发展密切相关,其在宫颈癌组织中的表达呈明显正相关;