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口腔癌是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，是近年来医学领域中研究的重要课题之一。近年来随着分子生物学技术的不断发展，从分子水平上研究肿瘤发生的机制及其与癌基因、抑癌基因的关系已成为肿瘤基因治疗的主要方向之一。癌基因与抑癌基因的突变、失活、表达异常是导致口腔癌的主要病因。口腔癌缺失-1（deleted in oral cancer-1, DOC-1）基因是Todd等于1995年利用仓鼠口腔癌模型分离和证实的一个候选抑癌基因，p12蛋白是其编码的具有肿瘤生长抑制功能的蛋白。作为一种新的候选抑癌基因逐年受到医学研究者的关注。人类DOC-1位于染色12q24,cDNA全长为1627bp,编码115个氨基酸,具有4个外显子,p12分子量为12.4kDa。DOC-1可以诱导仓鼠口腔恶性角化细胞的凋亡。p12蛋白通过两种重要的细胞伴侣（细胞周期依赖性蛋白激酶2和DNA聚合酶α）而对细胞周期中的S期进行调控。p12蛋白是一种CDK2的相关蛋白，对激酶的活性起负调控作用，并通过下调活性CDK2的表达水平，减弱对Rb基因活性的抑制，从而抑制肿瘤的生长，并且在鳞状细胞癌中异位表达p12后可以转变细胞系的恶性表型，部分是因为p12与CDK2和DNA聚合酶α结合，从而抑制了他们的活性。在正常的上皮细胞系中，TGF-β-1可以诱导p12的表达转录，反过来p12可以调节TGF-β-1的生长抑制活性。为了进一步研究DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控，获得该蛋白的抗体成为当前的首要任务。本研究采用RT-PCR的方法从正常人脑组织中克隆得到DOC-1基因的编码序列（Coding Sequence），经测序证实正确后，将该段序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中，诱导表达得到分子量约为38kDa的GST-p12融合蛋白。利用该表达产物免疫兔子，获得了抗p12DOC-1的多克隆抗血清，为下一步研究DOC-1的功能奠定了基础。实验目的：本课题研究的目的是通过克隆DOC-1基因，构建原核表达载体并纯化出融合蛋白，制备多克隆抗体的，而为下一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制提供重要工具。实验方法：1.从人胎脑组织中提取总RNA,根据GeneBank(NM-004642)中DOC-1的CDS设计引物，经逆转录-聚合酶链式反应扩增出DOC-1的编码区序列，再通过基因重组技术将该基因片段依次克隆到pMD18-T和pGEX-4T-1载体中，构建融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-11，并经酶切、测序鉴定。2.测序正确后将重组后的质粒转化大肠杆菌，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白，确定目的基因的表达情况后，进一步大量表达，并经Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化后获得高纯度的融合蛋白。3.将获得的融合蛋白电泳后割下目的条带研磨作为抗原直接免疫家兔，制备兔的多克隆抗血清，运用Western-blot检测抗血清的滴度及免疫原性。4.利用制备的兔多克隆抗血清对正常口腔粘膜组织及肿瘤组织，进行免疫组织化学染色分析。实验结果：从人胎脑组织中提取总RNA，经RT-PCR后，获得一条约348bp的DNA电泳条带，产物分别与pMD18-T和pGEX-4T-1载体连接并转化大肠杆菌后得到阳性克隆，经序列分析表明，与GeneBank中DOC-1基因的CDS(NM-004642)完全一致。证明我们成功地构建了重组克隆载体pMD18-T-DOC-1和原核表达载体pGEX-4T-1-DOC-1。将载有目的片段的pGEX-4T-1重组表达载体转化大肠杆菌，IPTG诱导后经电泳分析表明在相对分子质量38kDa左右出现新的蛋白表达条带。用融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得抗血清。用Western检测抗血清的效价及抗原的免疫原性。显示原核表达的蛋白可与多克隆抗血清特异的结合，且抗体稀释度与免疫印迹条带大小呈正相关。利用制备的多克隆抗血清，通过免疫组织化学的方法，在正常口腔粘膜组织中检测到免疫阳性细胞而口腔鳞癌组织中未见阳性细胞。实验结论：成功构建了pGEX-4T-1-DOC-1原核表达载体，得到高纯度的GST-p12融合蛋白，获得了兔来源的抗p12DOC-1血清，经蛋白免疫印迹杂交反应检测证实所得的抗体具有较高的特异性和效价,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础。总之，p12多克隆抗体的制备，为进一步研究p12的功能与调控提供了实验工具，也为进一步研究p12在口腔癌发生中的作用奠定了实验基础。