离体培养的神经网络是一种用于研究神经系统的简化模型,对于研究神经系统学习、记忆、可塑性、连接性和信息处理等相关神经科学问题具有重要的价值。微电极阵列是一种集成了数十或者更多个微采集单元的元件,具有无损伤性、环境可控性和操作简便等优点,能够以无损的方式长期、实时的检测离体神经元的电生理活动,为离体神经网络的相关研究提供了一种有力的研究手段。目前,微电极阵列系统已经在神经突触可塑性、神经网络功能连接与再生、神经网络发育规律研究、生理节律以及神经药理毒理学等方面有了大量的应用,成为神经生物学相关研究领域的重要工具和手段。微电极阵列最早出现于1972年,经过数十年的发展,相关研究已取得了明显进展。出现了多种不同用途的微电极阵列和系统,部分常规微电极阵列和系统已经达到了较高的水平,并且实现了商业化,如德国MCS系统等。尽管商业化系统做工精细、软件界面美观人性化、数据处理功能强大而且系统稳定,但是存在价格昂贵、易损耗等不足,为相关研究的大量开展带来沉重的经费负担。此外,商业化的产品功能相对固定,难以针对具体的研究要求进行改造升级,因此常出现无法满足具体实验需求的情况。基于此,国内外不少实验室均在尝试开发自己的微电极阵列系统,以更好地满足特定的实验需求。在基于微电极阵列的离体神经网络研究中,首先要在微电极阵列上开展离体神经网络的构建研究,这一过程常面临着几个关键问题。如何提升神经元在微电极阵列表面粘附与存活是其中的关键问题之一。在微电极阵列的制作过程中,一般会使用二氧化硅、氮化硅或者一些高聚物材料作为电极导线的绝缘材料,这些材料不能保证优良绝缘性的同时兼具有良好的生物相容性,而且神经元本身的细胞粘附能力较差,因此对微电极阵列的表面进行适当的修饰,以改善其生物相容性,促进神经元的粘附,成为基于微电极阵列进行神经网络构建亟需解决的首要问题。国际上用于微电极阵列表面涂层修饰的材料有：Matrigel、胶原、多聚赖氨酸、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和聚乙烯亚胺等。其中,Matrigel来源于天然的细胞外基质成分,富含多种生长因子和细胞外基质蛋白,具有良好的生物相容性和生物活性,是一种非常优良的表面涂层修饰材料。在以往的报道中,尽管Matrigel已在微电极阵列表面涂层修饰中得到了应用,并取得了良好的结果,但其中的许多关键问题尚未得到阐明,尤其是在Matrigel浓度对神经元粘附与存活影响方面,相关研究尚未报道。所选择的细胞接种密度是否合适是影响构建的离体神经网络质量的另一个重要因素。在微电极阵列表面上进行神经网络构建时,为了更好地促进神经元的存活和粘附,研究人员通常会以较高密度接种。然而,研究表明,不适当的神经元密度对于神经网络中神经元的长期存活、电活动发育与质量等均具有显著的影响。神经元的接种密度如何影响神经网络中神经电信号质量以及获取高质量神经电信号的最佳神经元接种密度如何目前仍没有统一的结论。基于上述分析,本课题首先进行了微电极阵列系统的研制,在此基础之上开展基于微电极阵列的神经网络构建与条件优化研究,进一步利用自研的微电极阵列系统与构建的神经网络研究平台,初步开展了神经网络电刺激与药物刺激反应特性研究,以验证本系统在神经网络相关研究中的适用性和可靠性。本课题的主要研究内容分为以下三个部分：第一部分：微电极阵列的制备及多通道电生理检测系统的研制。本部分研究利用印刷电路板开发技术进行了多通道电生理检测系统硬件部分的制备,开发了基于Lab VIEW的数据采集软件系统,并使用微加工技术进行了平面微电极阵列、琼脂糖井型微电极阵列和印章图形化微电极阵列的制作。所研制的多通道采集系统,输入噪声Vrms<2μV、带宽为10～10000Hz、放大倍数为1000倍、多通道采样频率最高可达20KHz,可以进行32通道的数据采集、滤波和存储,总共造价小于3万人民币,其造价远远低于商业系统的售价(超过50万元)。所研制的平面微电极阵列具有较好的电学特性,可用于神经网络研究,此外本研究成功研制了琼脂糖井型微电极阵列和印章图形化微电极阵列。第二部分：基于平面微电极阵列的二维神经网络的制备与条件优化研究。本部分研究使用不同浓度的Matrigel铺板,并将分离培养的皮层神经元接种在微电极阵列上,观察其对细胞粘附和活力的影响,摸索最佳的Matrigel铺板浓度。然后,在最佳Matrigel浓度铺板下,在微电极阵列的表面按照500个/mm2、1000个/mm2、2000个/mm2、4000个/mm2和8000个/mm25种密度进行接种,以期获得信号质量较高的神经元网络。结果表明,本部分研究成功分离出了皮层神经细胞,免疫荧光结果表明,7天的皮层培养物中包含MAP2阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞等。将微电极阵列以不同浓度Matrigel铺板之后,细胞的粘附情况不同,低浓度Matrigel铺板的微电极阵列上细胞粘附数量较少,高浓度Matrigel铺板的微电极阵列上粘附数量增多,但是容易出现聚集现象,微电极阵列使用浓度为0.2-0.4mg/mL的Matrigel铺板后神经元粘附的数量较多且均匀性最好。不同细胞密度接种的微电极阵列上细胞培养物的MAP2免疫荧光染色结果表明,随着接种密度的增加,MAP2阳性的细胞数也会增加,但是相比于2000个/mm2的接种密度而言,8000个/mm2接种密度条件下MAP2阳性的数量仅增加了不足2倍,细胞核染色结果表明不同接种密度构建的神经网络培养14天后存活的细胞密度相似。信号记录的结果表明,神经培养物培养约1周开始出现电活动,随着培养时间的延长,神经网络的电活动逐渐增加。比较而言,以2000个/mm2细胞接种密度构建的神经网络在培养过程中可以检测到最为频繁的脉冲和同步簇发放电活动。第三部分：基于平面微电极阵列神经网络电刺激与药物刺激反应特性研究。在基于微电极阵列的神经网络电刺激反应特性研究方面：本部分研究使用自研的微电极阵列系统,分别对神经网络进行先正后负和先负后正不同强度的电脉冲刺激来确定最佳的电流脉冲刺激条件。然后在细胞培养第10天、14天、18天、22天时,分别对16个电极进行电刺激同时记录其他电极的响应情况,进行神经网络自发发育过程中的电刺激-响应性特征的研究。结果表明,先负后正强度为10μA的电流刺激(正负相持续时间均为400μs)施加在活性电极(有自发电活动的电极)几乎可以100%的诱发出响应,重复10次刺激获得响应的结果排除了响应信号为自发电活动的可能。在细胞培养第10天、14天、18天、22天时,对16个电极进行重复电刺激后绘制的神经网络刺激-响应性特征图谱,神经网络的连接数随着培养天数的增加而增加,培养至22天时大部分的电极之间都存在着刺激-响应性。这一研究结果与文献报道的相关结果相一致,表明自研的微电极阵列系统具有可靠性和稳定性,并可以联合电刺激手段进行神经生物学方面的相关研究。在基于微电极阵列的神经网络药物刺激反应特性研究方面：本部分研究使用自研的微电极阵列系统,考察不同浓度L-谷氨酸钠和GABA刺激对微电极阵列上神经网络电活动的影响,来验证自研系统在药物评价方面的适用性。结果表明,在一定的浓度范围内,随着L-谷氨酸钠的浓度的增加,神经网络平均脉冲率与平均簇发放电率均表现为增加的趋势,达到平台期后随着药物浓度的增加,神经网络活动反而会由于L-谷氨酸钠的兴奋性神经毒性而受到一定抑制。γ-氨基丁酸(GABA)为脑内的重要的抑制性神经递质,在本研究中,其对神经元网络结构的影响与浓度相关,随着浓度的增加,神经元网络结构的平均脉冲率、平均簇发放电率均下降,且在浓度为10μM时,神经元网络结构中的信号被完全抑制。上述药物评价的结果符合药物作用效能,与文献报道的相关结果相一致,表明自研的微电极阵列系统具有可靠性和稳定性,可用于基于神经网络的药物评价等相关研究。