效应因子是一类具有操控寄主先天免疫反应,加强病原菌在寄主内寄生感染的蛋白质分子。随着植物病原菌的深入研究,效应因子已经成为植物病理学家们研究病原菌与寄主互作分子机制研究的重要内容。随着生物信息学的发展,越来越多的植物病原菌效应因子的功能得到阐释。然而至今,还未见到对水稻纹枯病菌效应因子的发现和研究的相关报道,本文在本实验室对水稻纹枯病菌的全基因组测序组装和预测的基础上,对预测的候选纹枯病菌的效应因子进行生物功能验证和细胞定位方面的研究,为深入认识效应因子与水稻寄主互作分子机制提供理论依据。本研究的内容主要有以下几个方面：第一,候选效应因子基因克隆。基于本实验室完成的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)标准菌株AG1IA的全基因组测序工作,并运用生物信息软件预测了编码效应因子的候选基因。根据预测基因的序列设计引物,根据反转录获得cDNA,再进一步获得全长基因序列,并通过Sanger测序确认序列的正确性；第二,效应因子引发细胞程序化死亡(PCD)和寄主专化性(HST)研究。运用大肠杆菌异源表达技术获得候选效应因子蛋白,超声波破碎菌体后得到效应因子的粗蛋白,用粗蛋白侵染水稻、玉米叶片,初步鉴定该蛋白是否具有诱发PCD和HST功能。经蛋白侵染初步鉴定并获得9个具有效应因子功能的基因编码蛋白,通过蛋白纯化技术,应用纯蛋白对寄主引发过敏反应(HR)现象再次确认,后续实验选取其中两个效应蛋白深入研究。第三,效应因子在水稻原生质体内的亚细胞定位。为确认该效应因子蛋白在水稻植株中的靶标,本实验将其基因序列与荧光蛋白融合,为了使其本身的定位不被荧光蛋白影响,使该效应因子融合在荧光蛋白的N-端。使融合蛋白在水稻原生质体中表达,荧光共聚焦扫描显微镜观察后,结果显示该蛋白可能定位于水稻线粒体,具体是否定位于线粒体,有待经过线粒体标记基因试验进一步验证。第四,效应因子功能域中关键氨基酸位点的突变分析。为了确认该效应因子中的功能位点,本研究拟对功能域中的疏水性氨基酸进行定点突变,以确定其是否是关键氨基酸。因为该效应因子具有信号肽,我们首先删除信号肽,克隆剩余序列,并进行致病性鉴定,以确认信号肽对于致病性是否是必须的,本研究已对关键氨基酸进行预测与突变体构建,其表达验证的工作尚在进行中。本研究基于本实验室对立枯丝核菌标准菌株的全基因组测序,分泌蛋白及效应因子的预测,通过实验验证初步确认了两个完全新型的效应因子蛋白基因AG1IA05473和AG1IA008560(已申请专利)。通过预测分析,AG1IA005473编码的蛋白在N-端具有信号肽,并分泌到胞外；C-端具有CtaG-Cox11结构域,具有细胞色素C组装蛋白(cytochrome c oxidase assembly protein)的功能,荧光共聚焦扫描电镜观察,该效应因子作用于水稻寄主的线粒体细胞器；AG1IA008560编码的蛋白在N-端也具有信号肽,C-端具有丝氨酸蛋白酶结构域,其蛋白产物初步定位于水稻细胞核。后续关于基因敲除、互补、水稻细胞内受体基因的确认以及引起水稻发病的信号通路的研究工作正在开展中。总之,本研究初步确定了该蛋白具有效应因子的生物功能以及作用的靶细胞器,为纹枯病与水稻互作机制的研究提供了分子水平的证据,进一步的研究还有待后续工作的开展。