卵巢组织冷冻和移植是目前保存幸存癌症患者生育力的最理想的方式,全球已有约140名婴儿顺利出生,且移植后60%左右患者在三个月内恢复内分泌功能。目前均采用卵巢组织皮质移植,属于无血管吻合的移植。因此,在新生血管建立和缺血再灌注损伤中,约有2/3的卵泡丢失,明显影响移植后卵巢组织内分泌功能的恢复。一些研究使用促血管生成物质,抗氧化剂来改善移植结果,取得了一定的效果,但是对于最理想的药物和剂量选择,更深的机制和移植后的远期结果,尚未有一致的观点。本课题,继续探索卵巢组织冷冻移植的保护性物质,为改善卵巢冷冻移植的效果提供技术支持,为女性生育力保存作贡献。第一部分:小鼠卵巢组织玻璃化冷冻解冻效果的评估目的评估小鼠卵巢组织玻璃化冷冻解冻的效果。方法1.选取健康、雌性6-8周龄美国癌症研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠,随机分成两组:新鲜卵巢组和玻璃化冷冻解冻组。2.采用苏木素-伊红染色(HE)方法分析解冻后的卵巢组织卵泡形态,免疫组织化学方法检测抗原Ki67(Ki67)评估卵母细胞及基质细胞的增殖能力,TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测解冻后卵母细胞的凋亡。结果1.与新鲜卵巢组织比较,冻融后窦卵泡损伤最明显,可见窦卵泡萎缩或者闭锁,卵周颗粒细胞松散。原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡未见明显差异。2.冻融后ki67阳性信号主要表达在初级、次级和窦卵泡的颗粒细胞和卵泡膜细胞,卵巢间质亦可见。和新鲜卵巢组织比较,冻融后,卵母细胞的增殖能力和新鲜组无明显差异。3.冻融后的卵巢组织原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡保存完整,未见明显凋亡。TUNEL阳性主要表达在窦卵泡的颗粒细胞中。结论1.玻璃化冷冻能够较好地保存卵巢组织的形态和功能;2.玻璃化冷冻解冻损伤主要发生在窦卵泡。第二部分:辛伐他汀在冻融小鼠卵巢组织自体移植中的作用目的研究辛伐他汀能否改善冻融小鼠卵巢组织自体移植的效果。方法1.选取健康、雌性-6-8周ICR小鼠,卵巢组织玻璃化冻融后,自体移植至背部肌肉。随机分成两组,小鼠苏醒后,分别予以组①辛伐他汀和组②生理盐水对照组灌胃,每天一次,持续至移植后一周。2.两组分别在移植后3天,7天和21天回收卵巢组织,同时回收各个时间点的血清。3.两组移植后的3天,7天和21天:采用HE方法分析卵巢组织卵泡形态;采用竞争酶联免疫法检测血清雌二醇(E2)和卵泡刺激素(FSH)水平。两组移植后的7天:采用TUNEL方法检测卵母细胞的凋亡;采用免疫组化检测CD34抗原(CD34)表达,提示新生血管生成情况;硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)水平,黄嘌吟氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)水平,提示移植后的氧化应激。结果1.移植后3天和7天,辛伐他汀处理组比生理盐水组完整的原始卵泡率高、凋亡率低,移植后的21天,卵巢组织生长良好,两组都可见窦卵泡,辛伐他汀组完整的原始卵泡率和窦卵泡率均比生理盐水组高,差异有统计学意义。2.辛伐他汀组血清E2在移植后21天高于生理盐水组;血清FSH水平在21天低于生理盐水组。3.移植后3和7天,辛伐他汀组新生血管数较生理盐水组明显增多。4.生理盐水组移植后7天SOD水平高于3天。辛伐他汀组SOD水平移植后7天高于3天,MDA水平低于移植后3天。移植后3和7天,辛伐他汀组MDA低于生理盐水组,SOD高于生理盐水组。结论1.卵巢组织经历玻璃化冻融移植后,各级卵泡均有丢失;2.辛伐他汀可以通过促进新生血管形成和抗氧化能力,相对提高卵母细胞的存活率和促进恢复移植后卵巢组织的内分泌功能。第三部分:白藜芦醇在冻融小鼠卵巢组织自体移植中的效果和机制目的研究白藜芦醇对于冻融小鼠卵巢组织自体移植的效果和机制。方法1.选取健康、雌性6-8周龄ICR小鼠,卵巢组织玻璃化冻融后自体移植至肾脏被膜。随机分成三组,小鼠苏醒后,分别予以组①白藜芦醇、组②羧甲基纤维素钠和组③生理盐水灌胃,每天一次,持续至移植后一周。2.三组分别在移植后3天,7天和21天回收卵巢组织,同时回收各个时间点的血清。3.移植后的3天,7天和21天:采用HE方法分析三组的卵巢组织卵泡形态;竞争酶联免疫法检测三组血清E2和FSH水平;移植后7天,TUNEL检测三组卵巢组织内卵母细胞的凋亡情况。移植后3天和7天,反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测组①和组③沉默信息调节因子1(SIRT1)、核转入因子(NF-κB)、白细胞介素-6(IL-6)、MDA和SOD的表达。移植后第21天,从组①和组③回收的卵巢组织中获取卵母细胞,体外卵母细胞成熟培养和体外受精。结果1.在移植后的3天和7天,与生理盐水和羧甲基纤维素钠组比较,白藜芦醇组完整的原始卵泡率增加。在移植后21天,白藜芦醇组完整的的初级卵泡率和窦卵泡率均较其他两组高。在移植的7天,白藜芦醇组的凋亡卵泡率更低。2.在移植后的21天,白藜芦醇组血清E2高于其他两组;FSH低于其他两组。3.qRT-PCR结果显示,移植后3天,白藜芦醇组MDA和NF-κB低于生理盐水组,IL-6在移植后7天低于生理盐水组,SOD在移植后3天和7天高于生理盐水组,SIRT1两组无差异4.移植后21天,卵裂率白藜芦醇组虽高于生理盐水组,但无差异。最终两组无囊胚形成。结论1.白藜芦醇可以减少冻融小鼠卵巢组织自体移植的卵泡丢失。2.白藜芦醇可以在移植早期通过下调NF-κB,从而减少炎症因子IL-6的产生。3.白藜芦醇可以通过增加SOD的表达,减少MDA的产生,防止细胞膜脂质过氧化对卵母细胞的损伤4.不能说明白藜芦醇可以改善胚胎结局,仍需更多的实验验证。