论文部分内容阅读
目的:观察理中汤对脾阳虚证模型大鼠吸收功能的影响,探讨其调节小肠上皮细胞刷状缘膜囊(BBMV)上肽转运载体PepT1转运功能、影响PepT1的mRNA和蛋白表达的作用机制;并进一步寻找其中可能的调节途径及因素。方法:1.建立脾阳虚大鼠模型造模方法:采用SD雄性大鼠,灌胃4℃的10g/kg番泻叶液每日一次;皮下注射利血平0.5mg/kg隔日一次,游泳10min(水温38℃)隔日一次,利血平注射与游泳交替进行,以上造模因素持续3周后,通过一般症状观察、尿D-木糖排泄率检测、采集小肠组织,HE染色病理学检查等指标的观测评价,建立利血平复合因素脾阳虚证大鼠造模方法。2.理中汤疗效观察:雄性SD大鼠分为模型组和正常对照组。模型组大鼠用利血平复合因素造模法造模,正常对照组隔日皮下注射等体积生理盐水,每日灌胃蒸馏水但不游泳,第3周末通过一般症状观察、尿D-木糖排泄率检测判断模型成立。模型大鼠分为理中汤给药组和未治疗模型组,分别给予理中汤灌胃和水灌胃处理4周,通过一般症状观察、尿D-木糖排泄率检测、采集小肠组织,HE染色病理学检查和透射电镜下观察小肠黏膜细胞超微结构等指标的观测评价理中汤的治疗效果。3.雄性SD大鼠分为模型组和正常对照组。模型组大鼠用利血平复合因素造模法造模,正常对照组隔日皮下注射等体积生理盐水,每日灌胃蒸馏水但不游泳,第3周末通过一般症状观察、尿D-木糖排泄率检测判断模型是否成立。随机选取部分模型大鼠和对照组大鼠,采集血清,用ELISA法测定小肠黏膜上皮细胞内cAMP水平及血清中相关影响因素Leptin及细胞因子--TNF-α、IFN-γ水平;通过给大鼠十二指肠内注射肽类似药物β-内酰氨类抗生素头孢氨苄(cefalexin,作为小肠内PepT1转运标志物),采集给药后2h血清,用反相高效液相法测定其体内血药浓度,观察PepT1转运的状态;采集大鼠小肠黏膜,用RT-PCR法测定小肠粘膜PepT1mRNA含量;采集小肠组织,免疫组化法半定量检测PepT1蛋白在小肠黏膜上皮细胞刷状缘膜囊(BBMV)的表达;剩余大鼠停止造模因素分为治疗组和非治疗模型组:治疗组每日给理中汤水煎液灌胃,非治疗模型组每日给水灌胃,第4周末即实验第7周末处死大鼠,同前法采集标本测定同前法采集标本。结果:1.利血平复合因素造模大鼠至第3周,出现饮食减少、消瘦、皮毛杂乱无光、倦怠懒动、泻下烂便、体温降低、喜扎堆;尿D-木糖排泄率明显低于正常大鼠(P＜0.05);透射电镜下观察,小肠黏膜柱状上皮细胞间隙变宽,粗面内质网间隙增宽,线粒体肿胀,大小不一,嵴断裂、减少或结构模糊,甚至有空泡样改变,与正常组结构有明显变化。2.脾阳虚模型组大鼠造模3周后,与正常对照组大鼠比较,cefalexin血药浓度显著升高(P＜0.01),小肠黏膜上皮细胞刷状缘膜囊(BBMV)上PepT1蛋白表达明显升高(P＜0.01),小肠黏膜PepT1 mRNA水平与正常组比较无显著性差异(P＞0.05),小肠黏膜cAMP与正常组比较,显著升高(P＜0.05)。3.停止造模4周后,理中汤治疗组大鼠活动度增加,大便软硬适中,皮毛恢复光泽,尿D-木糖排泄率与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05),大鼠小肠上皮细胞线粒体大小与正常对照组相似,结构清晰,大多数嵴较清楚,偶见嵴断裂现象;非治疗模型组大鼠活动度增加,大便软硬适中,皮毛恢复光泽,尿D-木糖排泄率与正常对照组比较显著性降低(P＜0.05),大鼠小肠上皮细胞线粒体大小不均匀,仍有嵴断裂、残留、空泡样改变。4.停止造模后4周,脾阳虚大鼠模型理中汤治疗组与正常组相比,cefalexin血药浓度、大鼠小肠黏膜BBMV上PepT1蛋白表达下降至正常水平(P＜0.05);小肠黏膜cAMP与非治疗组比较,显著升高(P＜0.05);非治疗模型组cefalexin下降至正常对照组水平,小肠黏膜上皮细胞BBMV上PepT1蛋白表达与正常组比较仍处高水平(P＜0.01);小肠黏膜PepT1 mRNA水平在3组动物中无明显差异。结论1.复合因素合利血平造模法建立脾阳虚证大鼠模型,经一般症状观察,尿D-木糖排泄率检测,细胞内超微结构观察,认为符合脾阳虚证模型要求,适用于理中汤小肠吸收药理学研究。2.温阳健脾方药理中汤对脾阳虚证大鼠的小肠吸收功能有改善作用,体现于改善症状,提高尿D-木糖排泄率,改善小肠黏膜柱状上皮细胞内超微结构。3.理中汤可使脾阳虚大鼠BBMV异常升高的PepT1蛋白恢复正常水平,提高cefalexin血药浓度和cAMP水平,提示理中汤治疗脾阳虚吸收功能不良的作用可能与cAMP-PepT1调节机制相关。