龋病是口腔主要疾病之一，它的发生率在过去几年呈逐渐上升的趋势。龋源相关性细菌的入侵是造成龋病的主要原因之一，它能够引起牙釉质、牙本质脱矿，进而造成牙髓组织损伤。外源性细菌的入侵能够启动机体的固有免疫防御反应。之前固有免疫防御反应的大部分研究主要集中于免疫细胞，而对于非免疫细胞研究甚少。在受到龋源相关性细菌及其毒力因子刺激时，牙髓成纤维细胞（Human Dental PulpFibroblast，HDPF）作为牙髓组织的主体细胞是否会参与固有免疫防御反应，相关研究较少。NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路在免疫细胞抵御细菌入侵的过程中发挥着重要作用，但是它是否存在于HDPFs中，调节该细胞的固有免疫防御反应鲜有报道。此外，目前激活NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路的模式有多种，而在HDPFs中，该炎症复合体通路是如何被激活又是如何被调节，目前尚不清楚。本实验以HDPFs作为研究对象，在体外培养条件下，分析HDPFs中NLRP3/Caspase-1炎症复合体表达特征、刺激机制，为深入研究牙髓炎症反应的通路机制，阐明牙髓炎症发生发展的分子机理，进而寻找控制炎症发展的关键靶点提供实验依据。主要研究结果如下：1. HDPFs的分离、培养与鉴定。通过经典的酶联组织块法从新鲜健康的牙髓组织中分离出HDPFs，并进行扩大体外培养。采用流式细胞技术和免疫细胞化学技术对HDPFs的表面标记物进行鉴定，证明所培养出的细胞为高纯度HDPFs。2.正常HDPFs中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及相关蛋白检测通过免疫细胞化学技术对HDPFs进行染色，证明在细胞胞浆中表达NLRP3炎症体及其Caspase-1蛋白；通过半定量PCR对HDPFs的基因进行检测，证明在细胞的基因中也表达NLRP3炎症体和Caspase-1蛋白以及其相关调节分子P2X7和促炎症因子IL-1β。3.不同刺激条件下，ATP、变异链球菌对HDPFs中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因的影响利用荧光实时定量PCR检测变异链球菌和ATP共同刺激后，HDPFs中NLRP3、Caspase-1、P2X7、IL-1β基因的变化。结果表明：在ATP和变异链球菌共同刺激下，NLRP3、Caspase-1、P2X7、IL-1β mRNA与对照组进行对比，呈显著上调。4.检测ATP、LPS作用下HDPFs中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因、相关蛋白的变化及其调节通路研究通过荧光实时定量、Western blot和ELISA技术检测了不同刺激条件下，ATP、LPS作用于HDPFs中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及其相关蛋白的变化。结果显示：单纯LPS刺激并不能激活NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路；而单纯ATP刺激虽然能够部分激活NLRP3炎症体和Caspase-1蛋白，但不能诱导下游分子IL-1β释放；先经过ATP预刺激，再用LPS刺激细胞，能够激活细胞膜表面分子P2X7，进而激活NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路，诱导下游分子IL-1β的释放，参与固有免疫防御反应。在不同刺激时间点，ATP、LPS作用于HDPFs中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及其相关蛋白的变化的研究结果表明：ATP先预刺激2h，再与LPS共同刺激6h后，P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β基因及其相关蛋白的变化达到了最高峰，而LPS刺激12h，24h后，各个基因和相关蛋白的变化呈逐渐下降趋势。两种抑制剂KCl和Glibenclamide（Gliben）作用后，ATP和LPS共同刺激NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路下游分子IL-1β的变化研究结果证明：不论是细胞外给予高浓度的K+还是选择性抑制剂Gliben都能明显的抑制下游分子IL-1β基因和蛋白的表达。活性氧族（Reactive Oxygen Species，ROS）抑制剂N-Acetyl-L-cysteine （NAC）作用下，ATP和LPS共同刺激NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路下游分子IL-1β的变化实验证明NAC能够明显抑制下游分子IL-1β基因和蛋白的表达。综合以上的研究，我们对HDPFs中NLRP3/Caspase-1炎症复合体通路的调节机制进行了初步的探索和研究，这些研究结果有助于我们进一步研究该炎症体通路，揭开炎症的发生发展机制，从而进一步为临床转化医学研究创造条件。