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微小RNA(microRNA,miRNA)是一类单链非编码小分子RNA,其通过与靶m RNA的3’端非翻译区结合,引起靶m RNA降解或者翻译抑制,产生转录后基因沉默,从而调控基因的表达。已有大量研究表明,miRNA基因的表达和蛋白编码基因一样受到表观遗传调控,其表达下调可能与miRNA启动子区CpG岛的甲基化有关。miR-200c是与乳腺癌转移密切相关的miRNA,尽管miR-200c基因的甲基化与多种肿瘤的发生、发展有关,但限于miR-200c基因关键性CpG位点的确认尚存争议,以及检测方法的局限性,使得miR-200c基因的甲基化检测在组织标本中的应用尚未得到普遍的开展。目的:确认miR-200c基因甲基化的的关键性CpG位点;建立miR-200c基因甲基化检测的定性与定量MSP分析方法,并应用于乳腺癌组织标本的分析。方法:采用原位miRNA杂交技术检测miR-200c在乳腺病变组织中的表达;去甲基化药物5-Aza-Cd R对四种乳腺癌细胞株进行处理,qRT-PCR方法检测乳腺癌细胞中miR-200c的表达水平;运用在线软件预测miR-200c基因启动子区的CpG岛;亚硫酸氢钠修饰后克隆测序对5-Aza-Cd R处理的乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛11个CpG位点进行检测;建立MSP与d HPLC方法检测乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛甲基化水平;应用MSP定性与定量方法对乳腺癌癌灶组织和癌旁组织检测miR-200c基因CpG岛甲基化。结果:1、原位杂交结果显示,乳腺癌组织中miR-200c表达与正常和良性乳腺病变组织相比,并无统计学差异;2、qRT-PCR结果显示;与0μmol/L对照组相比,5μmol/L的5-Aza-Cd R处理组中BT549与MDA-MB-231细胞株的miR-200c水平明显增高(p<0.05),而MCF7与T47D细胞的miR-200c水平变化不大;3、网站预测结果显示,在miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛,包含11个CpG位点;4、亚硫酸氢钠克隆测序结果显示,0μmol/L的5-Aza-Cd R对照组中,miR-200c表达高的MCF7和T47D细胞株miR-200c基因11个CpG位点甲基化频率与甲基化总频率明显低于miR-200c表达低的BT549和MDA-MB-231细胞株;5、建立的MSP与d HPLC方法验证了miR-200c基因CpG岛在MDA-MB-231细胞株中高甲基化与MCF7细胞株中低甲基化;6、乳腺癌组织定性和定量MSP结果分析提示,miR-200c基因的甲基化频率在癌灶组与癌旁组中未见统计学差异。结论:1、miR-200c编码基因起始位点前316~170bp位置处有一长度为147bp的CpG岛,此区域为关键性甲基化区域,该区域的CpG位点甲基化状态与miR-200c的表达有着紧密关联;2、建立的定性MSP与d HPLC方法能特异性区分乳腺癌细胞株miR-200c基因CpG岛甲基化状态,为后续乳腺癌组织标本的检测提供了便利。