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1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1D)是一种以胰岛素分泌绝对不足,胰岛β细胞进行性破坏为主要特征的自身免疫性疾病,终生皮下注射胰岛素仍为目前治疗的主要手段。但终生皮下注射胰岛素给患儿带来了巨大的痛苦,且患儿残存的胰岛β细胞功能越少,对胰岛素的依赖性越大,血糖越不稳定,那T1D的急慢性并发症的发生越早,患儿预后越差。因此,积极保护T1D残存胰岛β细胞功能,具有十分重要的临床意义。由于T1D是一种自身免疫性疾病,细胞及体液免疫功能紊乱都参与了T1D的发病过程,因此,本课题拟用腺病毒介导的IL-10基因恢复细胞免疫稳态,同时利用抗CD20单克隆抗体恢复体液免疫稳态,以期观察联合用药对对NOD鼠T1D自然发病早期胰岛β细胞的保护作用,并研究其相关机制。本课题主要包含二部分内容:第一部分富集与扩增携有鼠白细胞介素-10基因的重组腺病毒载体目的纯化、富集、扩增携有鼠白细胞介素10(IL-10)基因的重组腺病毒。方法从脂多糖(LPS)培养的大鼠脾细胞中提取细胞总的RNA,逆转录多聚酶链反应(q RT-PCR)技术扩增IL-10 cDNA,将扩增出的IL-10 cDNA克隆于pAdtrack-CMV载体中,即构建出了pAdtrack-CMV-IL-10穿梭质粒。对该质粒行线性化处理,而后转化到含有腺病毒骨架结构的BJ5183大肠杆菌中,即可获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10。用Lipofectamin包装并转染人胚肾293细胞,收获重组腺病毒Ad-IL-10。用荧光显微镜观察,293细胞内有无绿色荧光。作为对照组,用上述方法对Ad-GFP,即不含目的基因的空腺病毒载体也进行扩增。最后用快速腺病毒感染性滴度试剂盒测定病毒滴度。结果在HEK293细胞内,携有绿色荧光蛋白和鼠白细胞介素10(IL-10)基因的重组腺病毒绿色荧光表达明显。富集并扩增腺病毒后,用快速检测腺病毒感染性滴度试剂盒,测定病毒滴度为1.0×1011pfu/ml。同样,只携有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP),在HEK293细胞内,也明显表达绿色荧光。富集并扩增空载体后,用相同试剂盒检测空载体滴度为1.0×1011pfu/ml。结论成功富集与扩增了携有鼠白细胞介素10(IL-10)基因的重组腺病毒载体及空载体(ad-gfp),为后续的动物实验奠定基础。第二部分腺病毒介导的il-10基因与抗cd20单克隆抗体联合干预对发病早期非肥胖性糖尿病鼠(nod)鼠胰岛β细胞的保护作用及机制研究目的观察腺病毒介导的il-10基因与抗cd20单克隆抗体联合干预对发病早期非肥胖性糖尿病鼠(nod)鼠胰岛β细胞的保护作用及机制研究。方法选择17-20周龄诊断t1d不超过3天的nod鼠35只,随机分为抗cd20单抗单独治疗组、抗cd20+il-10联合治疗组(联合组)、il-10单独治疗组(ad-il-10组)、空载体组(ad-gfp组)及生理盐水对照组(ns组)。分别尾静脉注射抗cd20单抗250ug,抗cd20单抗250ug+ad-il-10100ul,ad-il-10100ul,ad-gfp100ul,ns100ul,每3天1次,首剂加倍,共注射4次。期间密切监测小鼠血糖水平。自最后1次给药后,连续观察9周,处死全部小鼠。用he染色法观察胰岛炎性浸润情况;tunel法检测胰岛β凋亡情况;elisa法测定nod鼠血清il-4、il-10、c肽、tnf-α、inf-γ水平及胰腺胰岛素分泌情况;免疫组化法评估il-10、cd20的表达情况;qrt-pcr法检测小鼠胰腺il-10、cd20、胰岛素、bcl-2、bax基因表达情况;用westernblot法检测胰腺pro-caspase3、cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9、bcl-2、bax等相关蛋白的表达情况。结果联合组可降低小鼠血糖水平。联合组小鼠胰岛炎主要集中在0-1级,ad-gfp组和ns组主要集中在2-3级,联合组可明显降低nod鼠胰岛炎分级。联合组胰岛β细胞凋亡率较il-10单独组、ad-gfp组和ns组明显减低,p均<0.05。免疫组化示il-10可在胰岛局部高表达,cd20在联合组表达减低。qrt-pcr结果示:il-10在il-10治疗组和联合组高表达,cd20各组间表达无差异。联合组胰岛素基因高表达,与其余各组相比,p均<0.01;联合组胰腺bcl-2基因表达明显升高,而bax基因在联合组胰腺表达最低,因此,联合组bcl-2/baxmrna表达比值明显高于其余各组,p<0.01。westernblot结果示:联合组pro-caspase3、cleaved-caspase3、cleaved-caspase8、cleaved-caspase9表达均低于ad-gfp和ns组,p<0.05;联合组bcl-2蛋白表达升高,bax蛋白表达降低,bcl-2/bax比值高于il-10单独组、ad-gfp组和ns组p<0.05。结论腺病毒介导的il-10基因在胰腺局部高表达。腺病毒介导的il-10基因与抗cd20单克隆抗体联用,可促进nod鼠胰岛素的分泌,控制血糖,减轻胰岛炎。联合干预可以通过激活bcl-2抗凋亡通路,抑制tnf-α、inf-γ表达,阻断caspase-8--caspase-3和caspase-9--caspase-3凋亡通路,发挥对胰岛β细胞的保护作用。总之,抗cd20单克隆抗体与il-10基因联合干预,可以降低发病早期nod鼠胰岛β细胞的凋亡,对残存胰岛β细胞功能具有一定的保护作用。