研究背景肺癌是危害人类健康的最常见肿瘤之一,高居恶性肿瘤的首位,近年来在世界范围内发病率和致死率都呈急剧上升的趋势。非小细胞肺癌(no small cell carcinoma,NSCLC)占所有肺恶性肿瘤的80%,其中腺癌(adenocarcinoma,ADC)占NSCLC的60%,因此肺腺癌是NSCLC最常见的病理组织学类型。肺癌的传统治疗以手术切除辅以放化疗为主,近十年来分子靶向治疗在改善NSCLC特别是肺腺癌患者预后方面取得了巨大的进展,有效的延长了患者的生存时间。但是,即使治疗的手段不断进步,肺腺癌患者的5年总生存率仍低于30%,即使是肺腺癌Ⅰ期的完整切除肿瘤的患者,肿瘤的复发仍占有很大的比例(约30%);而大多数肺腺癌患者在确诊时即为晚期,因此传统化疗在晚期肺腺癌患者的治疗策略中占有主导地位。部分肺腺癌患者对放化疗甚至靶向药物产生的耐药现象,尤其是多药耐药(multidrugresistance,MDR)表型的出现依然仍是患者化疗失败和预后不良的重要分子事件之一。因此,寻找促进肺癌发生发展的薪的分子机制,明确新的分子靶点和逆转肿瘤化疗耐药的方法是预防复发转移和改善肺腺癌预后的有益探索。肺癌的发生发展和耐药发生机制复杂,涉及到多种抑癌基因和癌基因的表达失调。目前,细胞信号传到通路与肿瘤的发生发展以及肿瘤耐药的关系成为肺癌研究的新亮点。其中PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路是细胞内重要的信号传导通路之一,多种生长因子激活通路中的关键蛋白活化PI3K,使Akt磷酸化激活下游的多种靶基因,如BAD、mTOR、FKHR、GSK3β和MDM2等,从而促进细胞存活、生长、增殖和恶性转化等生物学过程和表型,与肺腺癌的发生发展和预后关系密切。抑癌基因PTEN(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)是这一通路的抑制分子,能通过使第二信使PIP3脱磷酸化为PIP2,拮抗PI3K/Akt细胞信号通路信号传递过程而发挥其抑癌作用。在肺腺癌中,PTEN的失表达率可达30～50%,是肺腺癌发生早期最常见的分子事件,失活机制除了基因突变和缺失之外,翻译后修饰可能也是其失活的重要机制。PTEN的泛素化是其在胞质泛素-蛋白酶体系中降解和影响蛋白稳定性的主要翻译后修饰过程,这一过程的增强可能是PTEN缺失表达的机制之一。由于PTEN-PI3K/Akt通路在诸多信号传导途径中的中心地位备受关注,目前认为,肺腺癌细胞中PTEN失活介导P13K/Akt信号通路活化,是促进肿瘤细胞发生恶性转化和化疗耐受的重要机制,这一通路异常还与患者的不良预后密切相关。NEDD4-1(Neural precursor cell expressed,developmentally down-regulated 4,NEDD4-1)是NEDD家族成员之一,是一种E3泛素化连接酶,可通过其协同蛋白Ndfip1等共同作用下使PTEN发生泛素化,多泛素化促进PTEN在胞质中的降解,单泛素化可发生细胞核转入,从而调控PTEN的稳定性和亚细胞定位,因此NEDD4-1介导的泛素化可能是调控PTEN的翻译后修饰的主要机制。多项研究证实,NEDD4-1的高表达和PTEN的表达缺失存在于大多数人类恶性实体肿瘤组织中,并与肿瘤的进展和化疗敏感性密切相关。新近研究发现NEDD4-1是某些恶性肿瘤,如前列腺癌、乳腺癌等患者的独立的预后因子。但是,NEDD4-1在肺腺癌中的表达和预后意义尚未可知,参与调控PTEN的表达以及对化疗耐受的关系和机制的研究鲜见报道。研究目的研究泛素化E3连接酶NEDD4-1在肺腺癌组织中的表达,及其与浸润转移和化疗敏感性等多种临床病理因素之间的相关性,并初步探讨其提示肺腺癌患者预后的价值。采用肺腺癌细胞株A549和耐药细胞A549/DDP细胞,通过转染特异性siRNA沉默NEDD4-1的表达,探讨对肺腺癌敏感细胞A549和多药耐药细胞A549/DDP的生长、凋亡、浸润迁移能力、EMT表型以及对化疗药物的敏感性的影响;初步分析NEDD4-1沉默对PTEN-PI3K/Akt信号传导通路的活性的调控作用和机制;探讨NEDD4-1沉默对耐药蛋白P-糖蛋白、LRP和MRP等的耐药相关蛋白的表达的影响;研究对NF-κb和AP-1等细胞转录因子在此调控过程中的影响;为肺腺癌的靶向性基因治疗和耐药逆转提供理论基础和依据。研究方法我们采用免疫组织化学的方法回顾性分析研究了 135例肺腺癌组织及对应癌旁组织中NEDD4-1、PTEN和p-Akt的表达,同时采用Western Blot和RT-PCR的方法研究了 20例新鲜肺腺癌组织中的表达,分析蛋白之间的相互表达关系及与各临床病理因素和预后的关系和临床意义。培养肺腺癌细胞系A549和耐药细胞A549/DDP,转染NEDD4-1的siRNA进行蛋白沉默,采用MTS方法检测细胞生存活性和对顺铂和紫杉醇等化疗药物的敏感性,Transwell小室和琼脂糖实验检测细胞干预前后迁移和浸润能力的改变,采用流式细胞学检测细胞凋亡,实时定量RT-PCR检测转染siNEDD4-1沉默效率和靶基因mRNA水平的表达,Western blot检测沉默前后细胞内NEDD4-1、PTEN、p-Akt和NF-kB的表达分析对PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路分子的影响;检测凋亡蛋白BAD、Bcl-2、Caspase和MDM2等的表达以及EMT表型相关蛋白Vimentin和E-cadherin等表达;采用激光共聚焦显微镜研究PTEN在细胞内分布和含量的改变,免疫共沉淀检测对PTEN泛素化状态的影响;同时Western blot检测NEDD4-1对细胞内P-gp、LRP和MRP等多药耐药相关蛋白表达的影响,分析NEDD4-1与肺腺癌发生发展,预后提示,细胞药物敏感性的关系,以及在调控PTEN-PI3K/Akt细胞信号通路活性中可能发挥的作用。结果1.NEDD4-1在肺腺癌组织中呈显著高表达状态,而在周围肺肿瘤肺组织中呈弱表达或阴性表达(P<0.01)。分析结果显示,NEDD4-1高表达与患者的肺门淋巴结转移状态、TNM分期和化疗耐受等临床病理因素密切相关(P分别<0.05),而与其他多种临床病理学因素均不相关。PTEN在肺腺癌组织中的失活率显著高于周围非肿瘤性肺组织(P<0.01),并与淋巴结转移、组织学类型、TNM分期和化疗敏感性密切相关(P分别<0.05),此外还与EGFR突变状态相关。P-Akt在肺腺癌中的表达较周围肺组织明显升高,差异有显著性意义,并与患者的临床分期和化疗耐受性相关(P<0.05)。NEDD4-1与PTEN表达呈负相关关系(r =-0.632,P = 0.01),而与P-Akt表达呈正相关关系(r = 0.689,P = 0.05)。同时Cox比例风险模型和Kaplan-Meier曲线分析检测显示NEDD4-1高表达和PTEN低表达与患者的不良预后相关(P<0.05),多因素分析结果显示NEDD4-1和PTEN是肺腺癌患者的独立的预后因子。2.SiRNA介导的NEDD4-1沉默诱导肺腺癌敏感细胞A549细胞生长抑制,抑制率为42.97 ± 3.04%;促进细胞发生凋亡;Transwell小室检测显示siNEDD4-1导致A549细胞的浸润和迁移能力明显下降;Western blot检测发现NEDD4-1沉默增加了 A549细胞质中PTEN的表达水平,同时激光共聚焦检测实验结果显示沉默后胞浆内PTEN和细胞核内PTEN荧光信号较对照组均有不同程度增强,而免疫沉淀显示PTEN泛素化水平降低。NEDD4-1沉默后细胞内p-Akt的活化程度降低,从而阻断了 PI3K/Akt细胞信号通路的活性,并调控其下游的多种靶蛋白的表达,如检测凋亡蛋白BAD表达升高,mTOR磷酸化水平降低,细胞核转录因子NF-kB p65蛋白表达降低。3.沉默肺腺癌耐药细胞A549/DDP中的NEDD4-1蛋白表达后,MTS检测发现细胞顺铂和紫杉醇等化疗药物的耐受性降低而敏感性增加,IC50值均有不同程度的降低:流式细胞仪检测发现细胞在化疗药物处理后的凋亡率增加;transwell小室显示NEDD4-1沉默后细胞浸润和迁移能力降低;琼脂糖克隆形成能力下降;罗丹明外排实验显示NEDD4-1沉默组细胞内罗丹明含量实验组高于对照组;Western blot检测结果显示PTEN表达增加p-Akt磷酸化水平降低,其下游凋亡蛋白BAD和Caspase表达上调而抗凋亡蛋白Bcl-2和MDM2表达下调;EMT相关蛋白E-cadherin表达增加而Vimentin表达下降;重要的是,NEDD4-1沉默还显示耐药蛋白P-gp、MRP和LRP蛋白的表达水平较干预前有所降低,其中P-gp蛋白和mRNA水平均降低并伴有其细胞转录因子NF-kB和AP-1下调(P均<0.05)。结论1.肺腺癌中NEDD4-1和p-Akt表达较周围肺组织明显上调,而PTEN表达缺失,三者均与肺腺癌的肿瘤进展和化疗耐受相关,多因素分析显示NEDD4-1高表达和PTEN低表达均与肺腺癌患者的不良预后有关。本结果提示NEDD4-1表达上调可能是肺腺癌发生发展中的常见分子事件,其高表达可能与肺腺癌患者的耐药表型出现密切相关,可能是预测肺腺癌患者预后的因子之一。2.SiNEDD4-1对肺腺癌NEDD4-1的沉默能有效的降低A549细胞内NEDD4-1的表达,抑制肺腺癌细胞A549的生长,增加细胞凋亡,细胞的浸润和迁移能力都明显降低,提示NEDD4-1表达上调可能促进肺腺癌细胞生长存活和的浸润转移过程,与肿瘤的复发转移能力及预后相关。NEDD4-1可能是促进细胞恶性表型的一种原癌基因。3.SiNEDD4-1对肺腺癌细胞NEDD4-1沉默后,细胞质PTEN表达增加而泛素化水平下降,并见在细胞质和细胞核中聚集量增加,这能有效下调磷酸化p-Akt水平,提示NEDD4-1介导的PTEN泛素化通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。此外,其下游靶蛋白BAD表达上调,磷酸化mTOR下调以及细胞录因子NF-Kb p65亚单位表达表达水平下降,均提示NEDD4-1表达上调通过泛素化过程拮抗PTEN的抗癌作用,活化PI3K/Akt细胞信号通路及其下游靶蛋白来诱导肺腺癌细胞生长存活和出现化疗耐受表型。4.SiNEDD4-1对肺腺癌细胞NEDD4-1转染沉默后,A549/DDP细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性均不同程度的增加,并检测到多药耐药蛋白P-gp、MRP和LRP的表达降低,提示NEDD4-1沉默能部分的提高肺腺癌细胞对化疗药物的敏感性,并可能通过调节PTEN增加凋亡、抑制EMT表型或降低耐药相关蛋白的表达部分逆转A549/DDP细胞的耐药性,这一结论提示NEDD4-1可能成为逆转肺腺癌化疗耐药的分子靶蛋白,其小分子抑制剂的研究为肺腺癌的治疗提供了新的思路和方法。总之,NEDD4-1在肺癌组织中高表达通过泛素化拮抗PTEN的活性,活化了PI3K/Akt细胞信号通路并作用于多种靶蛋白,从而促进了肺腺癌细胞的生长,浸润和迁移过程,同时还增加了肺腺癌细胞对于化疗药物的耐受性,并部分的促进了肺多药耐药相关的耐药蛋白的表达水平的增加,继而参与了肺腺癌的肿瘤进展过程,使患者出现肿瘤复发和转移,并提示患者的不良预后。因此,我们认为NEDD4-1可能使肺腺癌治疗的一个新的分子靶点,对于临床治疗提供了新的思路和策略。