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蚂蟥Whitmania pigra Whitman属于环节动物门(Annelida)水蛭科动物，以吸食螺蛳体液为生，其干燥全体为中药水蛭，具有活血化瘀功效，是许多中医治疗心血管病的主要原料。
中药水蛭的主要活性成分水蛭素类抗凝血酶物质，被认为是世界上最强的凝血酶抑制剂。目前对水蛭素的研究主要来源于吸血水蛭，而鲜见从非吸血蛭体内提取到水蛭素的相关报道。近年来蚂蟥在生理、分子生物学、遗传特性等方面进行了相关研究，但鲜有蚂蟥水蛭素等与抗凝相关基因的克隆、表达特性及功能研究方面报道。本研究蚂蟥在不同吸食阶段组织的抗凝活性、从抗凝基因的原核表达及抗凝基因在不同吸食阶段表达的变化规律等方面入手，为蚂蟥抗凝活性和抗凝机制的研究提供了基础资料，丰富了蚂蟥抗凝基因资源，为科学地进行药材加工及生产优质的蚂蟥药材和抗凝相关基因吸食阶段表达模式提供依据。主要研究结果如下:
(1)分别取成年蚂蟥吸食后第1d、3d、5d、7d和11d的唾液腺、嗉囊、肠和肌肉进行称重，同时，用凝血酶直接滴定法测定抗凝血酶活性。结果表明，不同阶段的抗凝血酶活性明显高于其他组织(P＜0.05)。在吸食后11d内，肌肉组织抗凝血酶活性随着停食时间的延长呈先升后降趋势，最高峰出现在吸食后第5d(P＜0.05):唾液腺、嗉囊、肠吸食后第1d抗凝血酶活性最高(P＜0.05)，随停食时间的延长呈逐渐降低趋势。整体抗凝血酶总量在吸食后第5d最高(P＜0.05)，比吸食后第1、3、7和11d分别提高49.5％、73.5％、69.1％和126.0％。
(2)根据蚂蟥转录组序列设计引物，对蚂蟥水蛭素基NwpHirudin进行了克隆、原核表达及重组蛋白活性检测，同时研究了吸食对蚂蟥wpHirudin的时空表达。结果表明，全长255bp的水蛭素基因，包含一个编码63个氨基酸的开放阅读框。编码的wphirudin蛋白有信号肽，属于亲水性蛋白。两级结构主要由α螺旋、伸展链、折叠和不规则卷曲组成。作为非吸血蛭类蚂蟥Hirudin基因编码氨基酸序列与其他蛭类Hirudin基因编码氨基酸序列相似性不是很高，均在41％～59％之间。SDS-PAGE结果显示，在E.coli BL21中成功诱导表达了Hirudin蛋白，与预期蛋白分子量大小一致，采用抗凝血酶直接滴定法检测到重组蛋白的抗凝血酶活性为15.19U。qRT-PCR结果表明，蚂蟥水蛭素基因在不同组织中的表达具有显著性差异，在唾液腺中表达最高。此外，wpHirudin在唾液腺，嗉囊，肠跟肌肉的表达量分别在吸食后的第3d，5d，7d达到最高。
(3)根据蚂蟥转录组序列设计引物，对蚂蟥wpGuamerin进行了克隆、原核表达及重组蛋白活性检测，同时研究了吸食对蚂蟥wpGuamerin的时空表达。结果表明，蚂蟥wpGuamerin基因全长295bp，相对分子量为9145.95Da，包含一个编码83个氨基酸的开放阅读框，与吸血蛭Guamerin氨基酸序列相似性均在29％～65％之间;wpguamerin编码蛋白无信号肽，属于亲水性蛋白，和两级结构主要由α-螺旋、延伸链条、折叠和不规则卷曲。SDS-PAGE结果显示成功地诱导在大肠杆菌BL21的蛋白的表达。与预期蛋白分子量大小一致，并采用抗凝血酶直接滴定法检测到了wpGuamerin蛋白具有抗凝活性。wpGuamerin在肌肉中表达量显著高于唾液腺，在嗉囊和肠中无表达;吸食后wpGuamerin在肌肉和唾液腺的表达量分别在第1d和3d达到最高。
中药水蛭的主要活性成分水蛭素类抗凝血酶物质，被认为是世界上最强的凝血酶抑制剂。目前对水蛭素的研究主要来源于吸血水蛭，而鲜见从非吸血蛭体内提取到水蛭素的相关报道。近年来蚂蟥在生理、分子生物学、遗传特性等方面进行了相关研究，但鲜有蚂蟥水蛭素等与抗凝相关基因的克隆、表达特性及功能研究方面报道。本研究蚂蟥在不同吸食阶段组织的抗凝活性、从抗凝基因的原核表达及抗凝基因在不同吸食阶段表达的变化规律等方面入手，为蚂蟥抗凝活性和抗凝机制的研究提供了基础资料，丰富了蚂蟥抗凝基因资源，为科学地进行药材加工及生产优质的蚂蟥药材和抗凝相关基因吸食阶段表达模式提供依据。主要研究结果如下:
(1)分别取成年蚂蟥吸食后第1d、3d、5d、7d和11d的唾液腺、嗉囊、肠和肌肉进行称重，同时，用凝血酶直接滴定法测定抗凝血酶活性。结果表明，不同阶段的抗凝血酶活性明显高于其他组织(P＜0.05)。在吸食后11d内，肌肉组织抗凝血酶活性随着停食时间的延长呈先升后降趋势，最高峰出现在吸食后第5d(P＜0.05):唾液腺、嗉囊、肠吸食后第1d抗凝血酶活性最高(P＜0.05)，随停食时间的延长呈逐渐降低趋势。整体抗凝血酶总量在吸食后第5d最高(P＜0.05)，比吸食后第1、3、7和11d分别提高49.5％、73.5％、69.1％和126.0％。
(2)根据蚂蟥转录组序列设计引物，对蚂蟥水蛭素基NwpHirudin进行了克隆、原核表达及重组蛋白活性检测，同时研究了吸食对蚂蟥wpHirudin的时空表达。结果表明，全长255bp的水蛭素基因，包含一个编码63个氨基酸的开放阅读框。编码的wphirudin蛋白有信号肽，属于亲水性蛋白。两级结构主要由α螺旋、伸展链、折叠和不规则卷曲组成。作为非吸血蛭类蚂蟥Hirudin基因编码氨基酸序列与其他蛭类Hirudin基因编码氨基酸序列相似性不是很高，均在41％～59％之间。SDS-PAGE结果显示，在E.coli BL21中成功诱导表达了Hirudin蛋白，与预期蛋白分子量大小一致，采用抗凝血酶直接滴定法检测到重组蛋白的抗凝血酶活性为15.19U。qRT-PCR结果表明，蚂蟥水蛭素基因在不同组织中的表达具有显著性差异，在唾液腺中表达最高。此外，wpHirudin在唾液腺，嗉囊，肠跟肌肉的表达量分别在吸食后的第3d，5d，7d达到最高。
(3)根据蚂蟥转录组序列设计引物，对蚂蟥wpGuamerin进行了克隆、原核表达及重组蛋白活性检测，同时研究了吸食对蚂蟥wpGuamerin的时空表达。结果表明，蚂蟥wpGuamerin基因全长295bp，相对分子量为9145.95Da，包含一个编码83个氨基酸的开放阅读框，与吸血蛭Guamerin氨基酸序列相似性均在29％～65％之间;wpguamerin编码蛋白无信号肽，属于亲水性蛋白，和两级结构主要由α-螺旋、延伸链条、折叠和不规则卷曲。SDS-PAGE结果显示成功地诱导在大肠杆菌BL21的蛋白的表达。与预期蛋白分子量大小一致，并采用抗凝血酶直接滴定法检测到了wpGuamerin蛋白具有抗凝活性。wpGuamerin在肌肉中表达量显著高于唾液腺，在嗉囊和肠中无表达;吸食后wpGuamerin在肌肉和唾液腺的表达量分别在第1d和3d达到最高。