论文部分内容阅读
食品中展青霉素的污染非常普遍,严重危害人体健康。利用微生物降解展青霉素前景广阔,本文筛选并鉴定出一株具有展青霉素高效降解特性的海洋酵母,对其生长特性、展青霉素降解特性、安全性和降解机理进行研究。1.建立了培养液中展青霉素含量的检测方法,并对验证了方法的有效性。样品前处理采用乙酸乙酯萃取、碳酸钠溶液净化、无水硫酸钠干燥,氮吹至干后,溶于乙酸溶液(pH 4.0)中。展青霉素检测采用高效液相色谱-紫外检测器,ODS反相柱进行分离,在276 nm下进行检测。该方法回收率为78.01-83.64%,相对标准偏差为3.09-9.70%,检测限和定量下限分别为0.08 μg/mL和0.24μg/mL。方法稳定性好,具有良好的精密度,前处理方法简单,试剂用量少,在短时间内可处理大批量样品,能够满足在实验室条件下展青霉素检测快速、经济的要求。2.筛选出一株能够高效降解展青霉素的海洋酵母34号,该菌株对展青霉素降解率高,具有良好的毒素耐受性,与陆生酵母相比,在展青霉素降解方面有很大优势。经Biolog鉴定、26S分子鉴定和系统进化树分析,确定34号酵母为奥默柯达酵母,将其命名为Kodamare ohmeri HYJM34。3.对K. ohmeri HYJM34生长特性进行研究,发现温度对酵母生长影响较大,最适培养温度在25-28℃。在pH 2-12之间酵母均可生长,pH为6时生物量最大。接种量对酵母生长影响不太明显,酵母生物量随着装液量的增大而逐渐减小。通过单因素实验、部分因子实验、中心组合实验及响应面分析,得出K. ohmeri HYJM34的最佳培养基组成为葡萄糖2%,蔗糖8.19%,酵母粉3%,MgSO4 0.25%, K2SO4 0.18%,培养24 h后酵母生物量可达到19.54±-0.28 g/L。与YPD培养基相比,酵母生物量提高了174.1%,说明该优化培养基显著提高了酵母的生物量。通过急性毒理实验对酵母安全性进行初步评价,结果表明小鼠经口毒性剂量大于15 g/kg·bw,该酵母为无毒级。4.研究了K. ohmeri HYJM34对展青霉素的降解特性。培养基中添加10μg/mL展青霉素时,酵母生长受到抑制,生物量略有下降,但影响不大。展青霉素降解动力学研究发现,K. ohmeri HYJM34在24h内对展青霉素的降解率接近100%,明显强于目前报道的其它展青霉素降解菌。在温度为35℃,pH为3-6,细胞浓度大于5×108个/mL时酵母降解展青霉素性能最佳；随着毒素初始浓度的增大,酵母降解展青霉素的能力逐渐下降；金属离了中Cu2+、Zn2’和Fe3’明显抑制酵母对展青霉素的降解,Fe2+和Mg2+明显促进酵母降解展青霉素,其中Mg2+浓度为5 mmol/L时,展青霉素降解率最高。5.对K. ohmeri HYJM34降解展青霉素机理进行初步研究。首先研究了酵母降低展青霉素的作用方式。酵母细胞灭活后,不能脱除展青霉素;对展青霉素处理的活性酵母细胞进行破碎,发现细胞壁和细胞内均不含有展青霉素,说明酵母对展青霉素的脱除是生物降解作用。对降解酶进行定位分析,结果表明, K. ohmeri HYJM34对展青霉素的降解是由细胞内和细胞膜上的酶共同作用的。通过HPLC和LC-TOF/MS对降解产物进行分析,结果表明展青霉素是在还原酶作用下发生降解,主要产物为(E)-ascladiol 和 (Z)-ascladiol,降解产物毒性较小,说明K.ohmeri HYJM34在展青霉素脱除方面具有应用潜力。