一、放射性脑损伤模型的建立以及VEGF蛋白在放射性脑损伤中的作用研究目的建立放射性脑损伤(radiation-induced brain injury, RBI)动物模型,研究RBI病理机制,并探讨脑血管内皮细胞(brain capillary endothelial cells, BEC)、胶质及神经细胞(gliacyte and neuron, G&N)表达血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)蛋白的生物学功能。方法健康SD大鼠随机分为假照组(Sham)和照射组(IR,20Gy电子线,6MeV),分别于照后1、3、7、14、28、42、56天被处死,取全部脑组织。分别通过HE染色光镜及透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察病理学变化,组织干湿比法测定脑组织含水量(brain water contents, BWC),免疫组织化学结合计算机图像处理检测BEC、G&N VEGF蛋白积分光密度值(integrated optical density,IOD)的变化。结果(1)照后第1天IR组即出现脑毛细血管间隙增宽,内膜破裂等血管源性水肿病理学表现,在照后第3、28天出现血栓形成高峰；IR组脑组织在观察期主要历经了脑血管内膜细胞受损、血管源性水肿、血栓发生、血栓消融、血管再通及新生等病理变化过程；(2)较Sham组而言,IR组的BWC自照后14天起明显增高,其中第14及28天升高有统计学意义；(3)IR组自在照后第1天起即出现VEGF染色阳性的BEC及G&N,并持续到观察终点,两者均在第14天达到表达高峰；(4)照后第1、14、42、56天,G&N VEGF蛋白IOD出现显著升高,BEC VEGF蛋白IOD在照后第1、14、42天升高具统计学意义；(5)BWC与G&N VEGF蛋白IOD存在部分正相关。结论(1)射线可致血脑屏障(blood brain barrier, BBB)损伤并诱发血管源性水肿的形成,后者参与了RBI的发生发展；(2)RBI模型中脑毛细血管内血栓的形成与消融可能导致了脑血流灌注以及BBB的双相变化；(3)VEGF蛋白在RBI急性期参与了诱导水肿、形成血栓,在RBI早发延迟期参与了血管修复与再生、血栓消融等事件。二、VEGF在RBI模型中的变化及分子间作用机制目的从细胞分子学层面进一步研究,以阐明VEGF mRNA及蛋白在RBI进程中的表达变化及与相关分子间的相互调控,并探索抗-VEGF在RBI发生后的治疗时机。方法通过实时荧光定量逆转录多聚酶链反应(QRT-PCR)分别检测VEGF、核转录因子(nuclear factor κB,NF-κB)、细胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1) mRNA表达变化,Western blot分别检测全脑VEGF、NF-κB、ICAM-1总蛋白含量的改变,通过统计学相关性分析评价三者基因转录层面相互作用关系。结果(1)IR组VEGF mRNA与Sham组相比,其在整个观察期均出现了明显的下调,其中第1、3、7、28、42天降低具统计学意义；(2)IR组VEGF总蛋白在照后第1、7天表达增高,但在第3、14、28、42、56天表达相对降低,从第42天起,VEGF总蛋白表达水平逐渐接近假照组水平；(3)IR组NF-κB mRNA仅在照后第1天较Sham组表达升高,但却无统计学意义,自照后第3天起其表达相对下降,其中第3及28天表达下调有统计学意义；(4)IR组NF-κB蛋白在照后第1、7、14、42及56时过表达,其中照后第7天达到蛋白表达峰值；但在照后3及28时,IR组NF-κB蛋白水平与Sham组接近；(5)IR组ICAM-1mRNA在照后第1、14天表达增高,其中第14天时上调有统计学意义；在第3及28天表达较Sham组下调有统计学意义；(6)IR组ICAM-1蛋白在照后第1、7、56天表达相对降低,但在照后第3、14、28、42天时表达明显升高,其中第28天时出现表达高峰；(7) VEGF、NF-κB、ICAM-1mRNA表达两两呈正相关。结论(1)RBI模型中VEGF基因转录功能受到相对抑制,VEGF总蛋白仅在损伤急性期升高,照后早期VEGF mRNA与蛋白表达变化相反可能与反馈抑制有关。(2)RBI模型大鼠脑组织中NF-κB基因在转录层面受到抑制,可能与NF-κB参与的凋亡抵抗与促凋亡平衡被打破相关；NF-κB蛋白表达水平波动且与mRNA表达变化不一致,可能与NF-κB基因转录后调控变化相关。(3)RBI模型中脑组织ICAM-1蛋白表达变化滞后于其mRNA表达,两者表达变化趋势协同。(4) VEGF/NF-κB/ICAM-1三个基因之间可能存在正向调控的环路。三、重组人血管内皮抑制素注射液在RBI模型中抗-VEGF作用的初探目的对重组人血管内皮抑制素注射液(Recombinant Human Endostatin Injection, Endostar)在RBI治疗过程中作用的进行评价。方法健康SD大鼠随机分为Sham组、单纯用药组(EN组)、IR组、照射+用药组(IR+EN),分别于照后1、3、7、14、28、42、56天被处死,取全部脑组织。通过HE染色光镜鉴别IR+EN的病理学改变,利用QRT-PCR、Western blot、免疫组化判定IR+EN组中VEGF基因转录、翻译、功能定位上的变化,利用体重测定、组织干湿比法及单因素COX回归分析评估Endostar应用于RBI的可行性。结果(1) Endostar应用于RBI治疗可能加重RBI急性期的血管源性水肿,但可在RBI早发延迟期逆转脑水肿趋势,同时延长血栓治疗窗。但神经元在干预作用下的获益并不明显；(2) Endostar应用于RBI治疗可在全段观察期内下调VEGF mRNA的表达,对比IR组,IR+EN组VEGF mRNA表达在照后第3、7及28天明显升高；Endostar应用于RBI治疗可促使VEGF蛋白在照后1、14、42及56天时表达明显下降,在照后第3、7、28天过表达,对比IR组,IR+EN组VEGF蛋白表达在照后第3、7、28及56天表达明显升高；Endostar应用于RBI治疗可诱导BEC上调VEGF蛋白的分泌,并在照后第7天到达分泌峰值,另一方面,可降低G&N VEGF蛋白的分泌；(3) Endostar应用于RBI治疗在RBI急性期可能加重脑水肿,但在RBI早发延迟期能减轻脑水肿的进展；(4) Endostar应用于RBI治疗可增加实验大鼠体重减轻的风险；(5) Endostar应用于RBI治疗,施予药物剂量在安全范围内。Endostar仅在RBI早期提升实验动物生存率,但从照后第5天起至观察终点,其生存率有明显下降,考虑影响因素为射线诱发的脑水肿。结论Endostar应用于RBI模型可延长RBI早期的血栓治疗窗,但未能有效控制急性期脑水肿。然而在RBI早发延迟期抑制VEGF的表达导致的严重治疗副作用也将不容忽视。