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丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染而引起的严重威胁人类健康的传染病,目前还没有研制成功有效的疫苗。HCV-E1包膜糖蛋白是HCV的结构蛋白之一,具有重要的受体结合位点和抗原表位,在病毒感染和宿主免疫过程中起着十分重要的作用。其分子和功能特性的研究对HCV预防和治疗的研究有重要意义。本研究通过构建基于HCV-E1包膜糖蛋白B细胞表位序列,通过序列比较,选取几个代表性基因型的中和性优势抗原表位的序列,再结合泛DR辅助性T细胞表位(PADRE),一起构建嵌合免疫原基因,克隆表达以获得HCV-E1免疫原。
同时,针对目前人用免疫佐剂的局限性,及具有高效免疫调节作用CpG ODN存在体内不稳定性,序列的多样性,作用具有物种和个体差异性等问题,研究设计并构建了一个具有多个不同CpG ODN的重组质粒,并将多个串连在一起,以克服CpG多样性和个体差异性带来的问题。同时,质粒在体内可有较高的稳定性,也可增加组织细胞对其的摄取以增加其和受体结合并激活免疫活性细胞的机会,以使CpG能最大限度地发挥其免疫调节作用。通过免疫动物,研究其免疫调节作用,以期该质粒或可用于疫苗免疫佐剂,也可用于感染、癌症和过敏性疾病的免疫治疗。
根据上述实验思路:(1)合成了包含多个基因型的具有免疫中和活性的表位基因,利用pBVILl载体,在大肠杆菌中获得高效表达,并得到有效纯化,获得了多型别HCV-E1表位免疫原。
(2)构建了一系列具有免疫激活作用的pUCpGs质粒,根据该质粒中所含有Multi-CpG激活单位的多少,分别命名为pUCpGs01,02,03……,直至:pUCpGs10。转化大肠杆菌,扩增纯化获得pUCpGs质粒纯品。
(3)通过免疫动物,证明了多型别HCV-E1表位免疫原具有很好的免疫原活性。pUCpGs系列质粒具有强烈的免疫佐剂活性,其中pUCpGs10质粒的佐剂活性还略强于弗氏完全佐剂,为人用免疫佐剂的研究奠定了基础。