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【研究目的】P2X7受体是以ATP配体的离子通道,由3个同源亚基组成,每个亚基有两个穿膜结构域、一个大的胞外环、一个短氮端和一个长碳端[1]。P2X7受体在上皮细胞以及免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、淋巴细胞等显著表达[1-3],ATP/P2X7受体可以诱导免疫细胞产生许多生物活动,如增强吞噬功能、诱发炎性小体形成、促进炎性介质释放等[4,5],与炎症反应密切相关。在炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)动物模型,P2X7受体发挥明显的促炎效应[6,7]。近年来还发现,P2X7受体在众多肿瘤组织表达显著[8],而且肿瘤微环境ATP含量丰富,可以激活P2X7受体[9,10]。研究表明P2X7受体对众多肿瘤的生长有重要影响,甚至还在肿瘤的侵袭转移过程中发挥作用。结肠炎相关性结肠癌(colitis-associated cancer,CAC)与IBD关系密切,是典型的炎症相关的肿瘤。CAC为肠道上皮源性的肿瘤,研究也证实结肠癌细胞表达P2X7受体[8]。P2X7受体可以通过调节炎症反应间接影响肿瘤进展,也可直接影响肿瘤细胞的生长。本文旨在研究P2X7受体在CAC进展过程中的作用及机制。【研究方法】1.结肠炎相关性结肠癌模型的建立在给予6-8周的雌性C57BL/6N小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)12.5 mg/kg后,分别在第2、5、8周给予2.5%的葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,DSS)饮用水,其余时间给予正常饮用水,总共造模时程为10周。2.Western Blot10μl蛋白样品上样于SDS-PAGE胶。电泳(100 V,150 min)、转膜(300 m A,90 min)。用5%的脱脂牛奶TBST溶液室温下封闭1 hr。配制待检测蛋白的抗体孵育,4°C轻摇过夜。TBST洗膜。根据一坑种属选择适当HRP结合的二抗室温孵育1hr。TBST洗膜。混合Luminol试剂的A液、B液,进行显色。3.细胞系及细胞培养本实验中HT29细胞购自上海和元生物技术有限公司。细胞培养所用的培养基为McCoy’s 5A完全培养基,细胞培养在5%CO2,37°C的细胞培养箱中。4.细胞免疫荧光配制溶液:2g蔗糖溶于50 ml 4%的多聚甲醛(PFA),固定细胞。PBS洗细胞。加入0.01 mol/L p H6.0的柠檬酸盐缓冲液,在80℃的水浴锅中煮20 min,取出,室温下自然冷却。PBS洗细胞。一抗孵育,4℃过夜。PBS洗细胞。二抗避光孵育1 hr。PBS洗细胞。加入Hoechst 33258染色液染细胞核,室温10 min。PBS洗细胞。用甘油封片保存,荧光显微镜下观察拍照。5.细胞活力检测待测样品加入CCK溶液,细胞培养箱中孵育2 hr。用酶标仪测定450 nm处的吸光值。6.细胞增殖检测待测样品加入Brd U溶液,细胞培养箱中孵育4 hr。去除上清液,加入Fixing/Denaturing溶液,室温下静置30 min。去除上清液,加入Brd U抗体溶液,室温下静置1 hr。去除上清液,用Wash Buffer洗细胞。加入HRP结合的二抗,室温下静置30 min。去除上清液,用Wash Buffer洗细胞。加入TMB底物,室温下静置30 min。加入终止液,用酶标仪测定450 nm处的吸光值。7.细胞凋亡检测消化细胞,用PBS洗涤,收集细胞。Binding Buffer悬浮细胞。加入FITC Annexin V混匀,室温避光孵育15 min。加入PI混匀,室温避光孵育4 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡。8.细胞周期检测消化收集细胞,弃上清,PBS洗涤细胞。加入75%乙醇,混匀,4℃过夜。离心收集细胞,弃上清,PBS洗涤细胞。加入PI/Rnase Staining Buffer混匀,室温避光孵育40 min后用流式细胞仪检测细胞周期。【结果】1、P2X7受体特异性拮抗剂BBG减缓了CAC小鼠的体重恢复,降低了CAC小鼠的生存率,促进了CAC小鼠肠道肿瘤的形成及CAC模型小鼠肠道肿瘤组织STAT3的磷酸化。2、P2X7受体激动剂Bz ATP抑制了CAC小鼠肠道肿瘤的形成和CAC模型小鼠肠道肿瘤组织STAT3的磷酸化。3、P2X7受体在HT29细胞呈阳性表达。4、P2X7受体激动剂BzATP引起HT29细胞空泡化。5、P2X7受体激动剂Bz ATP引起HT29细胞G1期阻滞,抑制了HT29细胞的增殖,导致HT29细胞活力降低,而对细胞凋亡无明显影响。6、P2X7受体激动剂BzATP抑制了HT29细胞STAT3的磷酸化。【结论】1、P2X7受体在小鼠CAC进展过程中发挥一定的抑制作用。2、人结肠癌细胞的P2X7受体可能通过抑制STAT3的磷酸化而抑制肿瘤细胞的增殖。3、P2X7受体激活可导致小鼠CAC肠道肿瘤组织STAT3磷酸化水平的降低,这可能是P2X7受体介导的抑制CAC进展的重要机制。