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对大多数在宿主细胞核内复制的病毒来说,病毒RNA输出(RNA export)是其基因转录后调节的重要步骤之一。1993年在HBV基因组上发现的一个片段(1151nt-1684nt)被定义为乙型肝炎病毒(HBV)转录后调节元件PRE(HBV post-transcriptional regulatory element, HPRE)。现有的研究认为其具有辅助转录产物从细胞核向细胞浆运输的功能,但机制尚未清楚。Zang等人用带电泳迁移率变动分析(EMSA)发现两种细胞蛋白能够与HPRE相互作用,其中一个35kDa的蛋白为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。但GAPDH如何影响HBV的复制和表达,目前还没有具体报道。本实验的研究目的在于从体外验证GAPDH与HPRE-RNA的结合作用,利用检测系统pDM138-HPRE探讨GAPDH在HPRE转录后调节的作用,然后过量表达GAPDH于HepG2 2.2.15细胞和瞬时表达HBs的细胞中,检测HBs表达量来阐明GAPDH在HBV的转录后调节机制中的功能。主要研究方法和研究结果:1.用线性化pGEM-HPRE质粒作为模板,在Biotion标记的碱基体系中用T7 RNA聚合酶,以体外转录的方法合成HPRE-Biotin RNA。在BL21(DE3)细菌里诱导大量表达重组体pET32a(+)-GAPDH的GAPDH-His蛋白,获得大量56KDa的蛋白,再采用Ni2+-NTA树脂亲和纯化,以SDS-PAGE进行初步鉴定,并以兔抗人GAPDH和抗His标签抗体来进行Western blot蛋白鉴定。2.利用M-280 Streptavidin磁珠和Biotin的特异性结合,可用磁力座分离复合物的特性,将洗涤后的沉淀复合物做Western Blot鉴定。用抗His和抗GAPDH单克隆抗体检测,实验组GAPDH-His+HPRE-Biotin RNA能形成复合物,可鉴定出目的蛋白条带,而对照组His+HPRE-Biotin RNA则没有条带出现。由此证明GAPDH-His蛋白能够与HPRE RNA结合。3.将表达人类GAPDH基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GAPDH ,与含CAT报告基因的pDM138及pDM138-HPRE和表达绿色荧光蛋白(GFP)的pEGFP-N1分组共转染293T细胞,转染48小时后通过流式细胞仪测定pEGFP-N1表达的GFP,来评估转染效率。用ELISA方法检测报告基因CAT的表达来验证蛋白GAPDH对HPRE功能的影响。报告基因CAT表达量经统计学分析显示:转染质粒pDM138-HPRE的细胞CAT表达明显增加;而共转染质粒pDM138-HPRE和pcDNA3.1(+)-GAPDH,CAT的表达受到明显抑制(p<0.05)。4.将GAPDH蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-GAPDH转染于HepG2 2.2.15细胞和瞬时表达HBs的293T细胞中,通过ELISA检测HBs的表达量。应用统计学分析显示:GAPDH蛋白在HepG2 2.2.15中过度表达对HBs的表达有明显的抑制作用(p<0.05)。通过对比pcDNA3.1(+)-HBs与pcDNA3.1(+)-HBs-HPRE的实验结果,证实GAPDH蛋白对HBs表达的抑制作用是通过HPRE来发挥的。结论:GAPDH和HPRE RNA能够在体外结合,并且GAPDH是HPRE的抑制性蛋白,能通过HPRE来调节HBs抗原的表达。