胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)是一种革兰氏阴性杆菌，属于巴斯德菌科，引起猪传染性胸膜肺炎(PorcineContagiouspleuropneumonia,PCP)，是一种高度接触性传染性呼吸道疾病。因其的广泛分布，给养猪业造成了严重的经济损失。　　细菌群体感应(QS)是细菌通过分泌自诱导分子(AIs)感应细胞密度和调控基因表达的现象，它控制生物发光、毒力因子表达、生物被膜的形成等行为。革兰氏阳性和阴性细菌中存在不同的专一性信号分子调节多种行为，而LuxS/AI-2系统利用AI-2作为信号分子，在革兰氏阳性和阴性细菌中都存在，在许多细菌的毒力和代谢中发挥重要调控功能。另外，AI-2分子的合成酶S-核糖高半胱氨酸酶(LuxS)是活性甲基化循环(AMC)中一个重要催化酶。在AMC途径中，LuxS催化S-腺苷高半胱氨酸(SRH)产生高半胱氨酸和AI-2的前体分子DPD。由于LuxS/AI-2系统具有代谢功能和调节细菌毒力等多种功能，因此，LuxS被认为是很有潜力的药物靶标。本实验室的前期研究表明，LuxS直接参与APP的AMC代谢，调控多种毒力因子的表达，而且是APP在宿主体内建立感染所必需的。因此，LuxS可能是抗APP感染的很有潜力的药物靶标。本研究克隆，表达并纯化了APP的LuxS蛋白，在体外建立了LuxS酶活反应体系，研究了LuxS的酶促动力学;基于酶活测定筛选了LuxS酶的抑制剂，测定了这些抑制剂对APP等5种病原菌的抑制活性及对宿主细胞的毒性。　　1.luxS基因的克隆与LuxS蛋白的表达纯化　　根据NCBIGenebank中提供的APP4074株的全基因组序列设计引物，以APP4074基因组为模板，采用PCR方法扩增了luxS基因的开放阅读框，将其连接到了表达载体pET-28a上，并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌中进行了高效表达，菌体蛋白上清用His-Ni2+亲和层析柱进行了纯化，对表达产物进行了SDS-PAGE和Westem-blot分析，得到了可溶性的，浓度为1.072mg/ml的纯度较高的重组蛋白(25KD)。　　2.LuxS酶酶促动力学研究　　采用DTNB显色法测定LuxS酶促反应产物高半胱氨酸(HCY)，测定了LuxS酶的初速度，确定了其最适反应酶浓度43μg/ml，最适反应时间为5min，最适温度为50℃，最适pH值为8.0。在最适反应条件下测定了LuxS酶对底物SRH的米氏常数Km为223.40μM，最大速率Vmax为15.36μM·min-1。　　3.基于酶活的LuxS抑制剂的筛选　　对163个化合物(Specs(Delft，Netherlands))进行了基于LuxS酶活的抑制性初筛，得到了5个抑制效果较好（抑制率＞20％）的LuxS抑制剂，确定了其中4个抑制剂是竞争性抑制剂（48号、75号、135号和150号），分别测定了它们的的抑制常数Ki(59μM，51μM，176μMand90μM)和半数抑酶浓度IC50(0.323mM，0.279mM，0.965mMand0.49mM);另外一个抑制剂（146号）是反竞争性抑制剂，无法求得Ki和IC50。　　4.LuxS抑制剂对细菌抑制活性的检测　　对筛选出的5个LuxS抑制剂，用BacTiter-GloTM微生物细胞活性检测试剂盒检测活菌数的方法，分别检测了它们对胸膜肺炎防线杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性，并测定了半数抑菌浓度(MIC50)，筛选出的150号抑制剂对这5种病原菌均有较好的抑制作用（MIC50均在200μM以下）。　　5.LuxS抑制剂的细胞毒性评价　　用CellTiter-Glo萤光细胞活性检测试剂盒检测活细胞数的方法，测定了5个LuxS抑制剂对BHK-21细胞的细胞毒性，及其半数细胞毒性浓度CC50（48号、75号为150μM，135号、146号和150号均大于250μM），结果表明，135号、146号和150号化合物的MIC50均低于其CC50，可作为潜在药物进行进一步的研究。