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目的B细胞是介导抗病毒体液免疫最重要的细胞,在机体的免疫系统中扮演重要角色,B细胞数量与功能紊乱,直接影响有效的抗病毒免疫应答。新近研究发现,B细胞作为适应性免疫应答细胞,却表达重要的“天然”模式识别受体——Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）7与9。TLR7主要识别病毒单链RNA（ssRNA）;TLR9明确识别的天然配体是CpG-DNA,广泛存在于细菌和病毒基因组中。TLR7与TLR9信号通路活化决定和影响B细胞的免疫功能。目前,对HIV/AIDS患者外周血B细胞数量变化的研究结论不甚明确。中国HIV/AIDS患者B细胞数量变化的研究尚未见报道。HIV/AIDS患者B细胞TLR7与TLR9mRNA表达水平如何,是否在HIV感染进程中发挥重要作用尚不明确。本文以中国辽宁未经高效抗逆转录病毒治疗的HIV/AIDS患者为研究对象,研究HIV/AIDS患者外周血B细胞数量及B细胞TLR7与TLR9mRNA的表达水平,探讨B细胞数量及TLR7与TLR9mRNA的表达水平与HIV感染疾病进程的关系,有助于我们深入了解HIV感染中与B细胞相关的致病机制,从而为艾滋病疫苗及其佐剂的研发开辟新径。方法1、研究对象1)由中国医科大学艾滋病研究所确认实验室经Western blot试验确认为HIV阳性的HIV/AIDS患者27例,年龄分布为20～72岁（41.9±13.1岁）,未接受抗病毒治疗。根据HIV/AIDS患者感染时间和CD4+T细胞数量分为典型进展HIV组（HIV组）:感染时间>5年,CD4+T细胞数量≥200个/μl,无艾滋病指征性疾病;典型进展AIDS组（AIDS组）:感染时间>5年,CD4+T细胞数<200个/μl,和/或合并艾滋病指征性疾病。2)16例HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康者为阴性健康对照,性别、年龄与研究对象匹配,年龄分布为25～47岁（35.1±9.3岁）。3)采集研究对象外周静脉血10ml。调查及采血前均征得研究对象同意,并签署知情同意书。2、T细胞与B细胞绝对值和比值测定将20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST试剂或20μl CD3/CD16+56/CD45/CD19TriTEST分别加入绝对计数管中,应用逆向加样法各加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACS MULTISET软件检测并进行自动分析,计算CD4+T细胞、CD8+T细胞与CD19+B细胞绝对值与比值。3、密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（Peripheral BloodMononuclear Cell,PBMC）将PBS稀释后的抗凝全血30ml沿管壁缓慢加至10ml Ficoll PaqueTM Plus淋巴细胞分离液液面上,400g、30min离心。吸取PBMC层移入另一离心管中。补充PBS至45ml,洗涤细胞2次后得到PBMC。4、CD19+B细胞分选应用MACS磁珠分选系统分选CD19+B细胞,严格按照说明书进行操作。每107PBMC细胞加80μl缓冲液与20μlCD19免疫磁珠,4℃孵育15min,每107细胞加2ml缓冲液洗涤细胞,300g、10 min离心,500μl缓冲液重悬细胞,使用LS柱子进行阳性分选。取106细胞加入20μl CD20-PE室温避光孵育25分钟,洗涤后进行流式细胞仪检测,应用Cellquest软件进行细胞纯度分析。5、提取CD19+B细胞RNA,逆转录成cDNA采用Qiagen公司的试剂盒RNeasy mini kit提取CD19+B细胞总RNA。使用紫外分光光度仪检测RNA浓度及纯度。取20μl总RNA,加入2μl Oligo（dT）15配制成RNA/引物混合物22μl,70℃5min热休克,立即冰上放置5min。用Promega公司的试剂盒ImProm-ⅡReverse Transcription System逆转录合成cDNA。逆转录反应体系:ImProm-Ⅱ5×Reaction Buffer 10μl,MgCl2 12μl,dNTP 2.5μl,RecombinantRNasin（?）Ribonuclease Inhibitor 20U,ImProm-ⅡReverse Transcriptase 2.5μl。向RNA/引物混合物中加入上述逆转录反应体系28μl（总体积50μl）。逆转录条件:25℃5min;42℃1h;70℃15min。所得cDNA于-20℃冰箱冻存备用。6、实时定量PCR设计目的基因TLR7、TLR9和内参GAPDH特异性引物,由invitrogen公司合成。采用ABI公司的SYBR Green试剂盒,应用ABI7500荧光定量PCR仪进行定量检测。25μl实时PCR反应体系:2×Power SYBR（?）Green PCR Master Mix12.5μl,上下游引物各1μl,cDNA模板2μl,RNase-free water8.5μl。反应条件:95℃10min热启动,95℃15sec变性、60℃1min退火及延伸40个循环。反应结束后进行融解曲线分析引物的特异性。用相对定量2-⊿⊿Ct法比较各组间TLR7或TLR9的mRNA相对表达差异。每一份标本均行复管检测,取其均值做为目的基因的表达水平。7、统计学处理所有资料采用SPSS16软件分析。数据均值±标准差表示,符合正态分布的数据采用单因素方差分析,并进行均数两两比较,使用Pearson进行相关性分析,不符合正态分布的数据采用Mann-Whimey U test进行比较,使用Spearman rank进行相关性分析,统计概率采用双侧检验,P<0.05时有统计学意义。结果1、中国HIV/AIDS患者外周血T细胞与B细胞绝对计数检测结果HIV/AIDS患者CD4+T细胞数量为（348.2±182.3）个/μl,显著低于健康对照组（821.7±217.8）个/μl,P=0.000;HIV组与AIDS组CD4+T细胞数量分别为（415.3±154.9）个/μl与（138.6±58.1）个/μl,均显著低于对照组,P=0.000。HIV/AIDS患者B细胞数量为（149.5±40.1）个/μl,显著低于健康对照组（209.1±102.6）个/μl,P<0.05;其中,HIV组与AIDS组B细胞数量分别为（152.0±42.2）个/μl与（141.3±33.6）个/μl,均显著低于健康对照组,P<0.05。HIV组与AIDS组外周血B细胞百分数分别为（7.1±2.7）%与（8.6±3.4）%,与健康对照组（9.2±5.5）%相比无差异。2、中国HIV/AIDS患者外周血B细胞与CD4+T细胞、CD8+T细胞的相关性HIV/AIDS患者外周血B细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关（r=0.534,P=0.006）;与CD8+T细胞数量不相关（r=0.301,P=0.107）。3、CD19+B细胞分选纯度应用MACS磁珠分选系统分选CD19+B细胞,分选所得细胞用流式细胞仪测定纯度,CD19+B细胞纯度大于90%。4、HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7与TLR9 mRNA表达与健康对照组的比较HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR9 mRNA的表达明显低于健康对照组（P=0.023）。HIV组TLR9 mRNA的表达与健康对照组相比无显著差异,P=O.05;AIDS组TLR9 mRNA的表达明显低于健康对照组（P=0.042）。各组间TLR7 mRNA的表达无统计学意义（P>0.05）。5、HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7与TLR9 mRNA表达与健康对照组CD4+T细胞的相关性HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR9 mRNA的表达水平与CD4+T细胞数量正相关（r=0.390,P=0.040）。HIV/AIDS患者外周血B细胞TLR7 mRNA的表达水平与CD4+T细胞数量不相关。结论1、HIV/AIDS患者外周血B细胞数量减少,而且B细胞数量与CD4+T细胞数量显著正相关,提示HIV感染中B细胞数量变化可能与疾病进程紧密相关。2、HIV/AIDS患者B细胞TLR9 mRNA的表达与健康对照相比明显下降,而且B细胞TLR9 mRNA的表达量与CD4+T细胞数正相关,提示TLR9 mRNA表达可能与疾病进程相关。