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黏膜疫苗研究的成功与否通常与免疫增强剂和抗原递送系统息息相关,GEM-PA表面展示系统是近几年黏膜疫苗研究中应用较多的抗原递送系统。革兰氏阳性增强基质(Gram positive enhancer matrix,GEM)颗粒是由乳酸菌经热酸处理后得到的细胞壁肽聚糖骨架,保持了原有菌体的形态大小、几乎无蛋白质和核酸大分子物质残留,安全性高且具有免疫调节功能,有助于增强疫苗的免疫效果;锚定蛋白(Protein Anchor,PA)能够特异性地非共价结合细菌细胞壁肽聚糖,目标抗原与PA融合表达后,可将该抗原高密度地展示在GEM颗粒表面。另外,GEM-PA展示系统可将蛋白抗原直接呈递给树突状细胞,激发机体最有效的黏膜免疫应答。首先,搭建乳酸菌细菌样颗粒表面展示技术平台。本试验选用安全级(GRAS)乳酸乳球菌1936和鼠李糖乳杆菌LGG作为GEM颗粒的制备原料,经10%TCA搅拌煮沸处理获得GEM颗粒,并通过电镜观察、RT-PCR检测和SDS-PAGE检测鉴定其处理效果。同时,挑选了两种候选锚定蛋白,分别为乳酸乳球菌自身表达的细胞壁水解酶Acm A和产单核细胞李斯特菌产生的胞外蛋白p60(28-245)。绿色荧光蛋白EGFP分别融合到两种锚定蛋白的N端作为报告蛋白。将锚定蛋白和GEM颗粒共同孵育结合,通过蛋白免疫印迹、电镜观察、荧光显微镜观察和荧光分光光度计法评价GEM颗粒与锚定蛋白的结合效率。结果表明,使用10%的TCA处理乳酸乳球菌1936和鼠李糖乳杆菌LGG均得到了GEM颗粒,经鉴定其大小形态均一,绝大部分无蛋白残留,1 U(2.5?109)LGG-GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为32个,1 U(2.5?109)1936-GEM颗粒样品中的DNA拷贝数仅为6667个。透射电镜观察发现结合在GEM颗粒表面的锚定蛋白呈絮状。荧光分光光度计法检测结果显示两种融合蛋白分别与LGG-GEM颗粒结合后的荧光强度差异不显著(P=0.309);乳酸乳球菌自身表达的Acm A与1936-GEM颗粒结合后的荧光强度强于产单核细胞李斯特菌产生的p60(28-245),其差异显著(P=0.014)。结果充分说明,乳酸乳球菌1936和鼠李糖乳杆菌LGG的GEM颗粒分别与锚定蛋白Acm A和p60组合使用,均能够成功地将目标蛋白展示在GEM颗粒表面。同时,在试验中发现鼠李糖乳杆菌的GEM颗粒热酸处理效果更好,并且该菌生长速度快,容易培养获得,其应用于表面展示具有优势。因此,本试验成功地搭建了乳酸菌细菌样颗粒表面展示平台。在建立了乳酸菌细菌样颗粒表面展示平台的基础上,进行类鼻疽细菌样颗粒疫苗的研究,主要分为颗粒疫苗的制备和疫苗初步免疫评价两个方面。将类鼻疽抗原蛋白BPSL1897、BPSL2287、Hcp2和Lolc分别通过Acm A、p60两种锚定蛋白展示到LGG-GEM和1936-GEM颗粒表面。经融合蛋白表达情况筛选出BPSL1897-p60、BPSL2287-p60和Hcp2-p60三种融合蛋白,将其与GEM颗粒结合后按1:1:1的比例混合,即为类鼻疽细菌样颗粒疫苗。以1 U/只的剂量滴鼻免疫BALB/c小鼠,且不加入任何佐剂,小鼠每隔15 d免疫1次,共免疫3次。经间接ELISA检测小鼠血清中特异性抗体Ig G效价最高可达到1:40000;类鼻疽细菌样颗粒刺激小鼠机体产生的Ig G2a和Ig G2b分型抗体水平较高,可以说明类鼻疽细菌样颗粒在小鼠体内激发了Th1型免疫反应;与相同剂量颗粒疫苗皮下注射免疫小鼠相比,滴鼻免疫组在小鼠肺洗液中可检测到较高水平的s Ig A,说明类鼻疽细菌样颗粒能够诱发较强的黏膜免疫反应。总之,本研究以Acm A和p60两种锚定结构域为基础,成功地搭建了乳酸菌细菌样颗粒表面展示技术平台。值得一提的是,本研究首次将产单核细胞李斯特菌产生的胞外蛋白p60(28-245)作为锚定蛋白应用到该技术平台中,并且鼠李糖乳杆菌GEM颗粒的初次使用在本研究中也取得不错的效果。运用乳酸菌细菌样颗粒表面展示技术构建的类鼻疽细菌样颗粒疫苗能够成功地诱发机体产生黏膜免疫反应和系统免疫反应,为研制新的类鼻疽黏膜疫苗的研究奠定了基础。