越来越多的夫妇会面临不孕不育的困扰。解决这个问题的基础是在分子水平阐释配子发生的分子机制,其中精子发生是一个极其复杂的细胞分裂和分化过程,从精原细胞的自我更新到正常精子的形成,任何一个环节发生错误都可能出现精子发生异常而导致不育。同其它蛋白质修饰一样,泛素化修饰对这一过程的调控是必不可少的。越来越多的证据表明各种泛素系统相关组分参与了精子发生的过程。本课题旨在利用蛋白组学技术发现小鼠睾丸精子发生中一些重要的泛素化修饰蛋白和泛素化相关酶,建立并优化针对泛素化修饰特异的蛋白质组学鉴定和定量技术,有助于阐明精子发生的分子机制,并为临床相关疾病的诊断治疗提供候选分子靶标。首先利用非富集策略,对睾丸泛素化修饰蛋白与泛素化调控酶进行鉴定。通过比较不同的二维分离鉴定蛋白质组学技术,发现第一维使用HP-RP(高pH反相分离)技术分离效果优于SCX(强阳离子交换分离),肽段在不同分离组分中的分布比较均匀;此外,质谱产生的蛋白定性信息比较多,大大提高了蛋白质的可信度。HP-RP分离技术可以与第二维低pH反相分离正交,用于复杂样品的大规模鉴定。利用这一技术平台构建了小鼠睾丸蛋白表达谱系,单次实验得到8511种蛋白质和88207种不同肽段。我们分析了小鼠睾丸蛋白谱系中泛素化蛋白鉴定情况,结果只鉴定到109个泛素化位点对应于76个底物蛋白。但是鉴定了274种泛素化酶(E1、E2和E3)和59种去泛素化酶(DUBs)。大量泛素化修饰调控酶的表达说明精子发生可能受到复杂的泛素化修饰调控。因此,我们构建了基于泛素化特征肽(K-GG)富集策略的蛋白质组学技术平台,并成功应用于小鼠睾丸精子发生中泛素化修饰蛋白的鉴定。与未经富集的蛋白质组学数据相比,该富集策略可以大大提高泛素化肽段在质谱仪器中的检测效率。通过2次生物学重复,一共鉴定到13717个泛素化修饰位点,对应于4200种底物蛋白。生物信息学分析提示这些泛素化修饰蛋白质与RNA转运、代谢通路、泛素介导的蛋白水解、DNA的损伤修复、免疫反应、内吞作用、细胞周期及凋亡等通路相关,该研究结果提示蛋白质泛素化修饰在精子发生的过程中可能发挥着重要的调控作用。最后,为了寻找泛素化修饰定量方法,对蛋白组学定量技术进行了研究,构建了TMT(串联质量标签)与18O定量技术平台。利用TMT定量技术研究了精原干细胞(SSC)增殖、迁移与分化相关的蛋白表达差异,并用western验证了定量的准确性。探讨了18O定量技术的标记效率、定量准确性,并利用18O定量技术与泛素化富集相结合的策略进行了泛素化修饰位点定量分析,为在睾丸中进行泛素化修饰特异的定量蛋白质组学研究奠定了基础。综上所述,成年小鼠睾丸蛋白表达谱系和泛素化修饰谱系的构建及分析,提示了蛋白质泛素化修饰在精子发生中的重要功能。通过生物信息学功能注释初步探讨了睾丸泛素化修饰蛋白质的生物学特性及生物学意义,为进一步研究泛素化修饰在精子发生过程中的调控机制提供了丰富的资源和研究思路。另外,本研究还构建并优化了蛋白定量技术平台,为后期寻找定量精子发生关键泛素化修饰蛋白奠定了基础。