第一部分瘦素对胃癌细胞侵袭的影响及机制研究研究背景胃癌死亡率居世界第二位,导致胃癌高死亡率的原因主要与晚期发生的侵袭和转移有关,及时捕捉预警信号并阐明肿瘤侵袭转移相关分子机制,对于胃癌的防治至关重要。研究表明多种因素参与此过程,其中肥胖易致癌症,是胃癌的风险因子之一。瘦素(Leptin)主要由脂肪细胞分泌,是重要的脂肪因子之一,参与多种癌症的发生。胃癌时瘦素水平升高,通过自分泌或旁分泌途径在胃癌发生发展中发挥重要作用,但是其确切影响和具体调节机制尚不清楚。肿瘤细胞通过合成大量基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs)降解细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM),是肿瘤发生侵袭、转移的关键步骤之一。膜基质金属蛋白酶-1(Membrane-type1matrix metalloproteinases, MT1-MMP)作为多种蛋白酶的“总开关”，除了能直接降解ECM,还可激活多种酶底物,间接降解ECM中的多种成分,发挥其促肿瘤侵袭作用。MT1-MMP与胃癌侵袭转移密切相关,但作为膜型分子,其发挥作用的前提是胞内生成及转运至细胞膜上,因而该阶段或许存在可对其活性进行早期干预的多种潜在靶点。近来有研究证实,瘦素可分别调控MMP-2、MMP-7和MMP-13在乳腺癌及胶质瘤中的表达,进而促进肿瘤的侵袭转移。但瘦素对胃癌细胞MT1-MMP的调节及其在侵袭中的作用,迄今未见报道。综上所述,基于本领域国内外研究进展及课题组的前期研究基础,我们体外观察瘦索对胃癌细胞MT1-MMP表达和侵袭的影响,探讨瘦素受体下游信号传导分子Akt、ERK1/2、STAT3介导驱动蛋白KIFs对MT1-MMP膜表达的作用,同时收集胃癌和匹配的癌旁组织标本,检测上述分子的表达,并分析其与临床参数的关系。本研究将进一步阐明胃癌侵袭转移机制,同时也为早期控制胃癌提供潜在治疗靶点。研究目的1.观察瘦素对胃癌细胞侵袭及MT1-MMP表达的调节。2.分析驱动蛋白1B(KIF1B)在瘦素调节胃癌细胞中MT1-MMP表达中的作用及对胃癌细胞侵袭的影响。3.阐明胃癌细胞中瘦素受体下游信号途径在调节MT1-MMP生成及KIF1B调节MT1-MMP膜表达的作用。4.检测胃癌及癌旁组织中瘦素、KIF1B、MT1-MMP表达,并分析三种分子之间的关系及其与临床参数的关系。研究方法1.瘦素对胃癌细胞侵袭的影响胃癌细胞(AGS)与不同浓度瘦素(0、50、100、250、500ng/ml)和瘦素抗体37℃培养24小时后,Transwell检测胃癌细胞侵袭改变,确定最佳瘦素作用浓度。胃癌细胞(AGS、MKN-45、MKN-28)分为未处理组(Control)、瘦素(Leptin).瘦素抗体(Anti-leptin)、瘦素+瘦素抗体(Leptin+Anti-leptin)组,37℃培养24小时后,Transwell检测胃癌细胞侵袭,胶原酶侵袭实验检测瘦素对胃癌细胞侵袭的影响。2.瘦素对胃癌细胞中MT1-MMP生成的影响胃癌AGS细胞分为Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin组,37℃培养24小时后,RT-PCR检测MT1-MMP基因表达变化,Western Blot检测MT1-MMP蛋白表达变化,流式细胞术和细胞表面生物素化技术检测膜表面MT1-MMP表达,分析瘦素对MT1-MMP表达的影响。同时明胶酶谱检测胃癌细胞培养上清中MMP-2表达。3.检测瘦素作用后胃癌细胞表达变化的KIFs分子,观察其在瘦素调节MT1-MMP表达中的作用及在胃癌细胞侵袭中的作用胃癌AGS细胞分为Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin组,RT-PCR检测KIFs基因水平表达变化,筛选表达变化的KIFs分子,然后Western Blot检测其蛋白水平表达变化。siRNA沉默相应KIFs分子,胃癌细胞分为Control、Con-siRNA、KIFs-siRNA、 Leptin、Leptin+Con-siRNA、Leptin+KIFs-siRNA组,37。C培养24小时后,RT-PCR检测MT1-MMP基因表达变化,Western Blot检测MT1-MMP蛋白表达变化,流式细胞术和细胞表面生物素化技术检测膜表面MT1-MMP表达。胃癌细胞分为Contro、Leptin、KIF1B-siRNA、MT1-MMP-siRNA、Leptin+KIF1B-siRNA、 Leptin+MT1-MMP-siRNA组、Leptin+KIF1B-siRNA+MT1-MMP-siRNA组,37。C培养24小时后Transwell检测胃癌细胞侵袭变化。4.瘦素对KIFs和MT1-MMP相互作用的影响免疫共沉淀分析与MT1-MMP相互作用的KIFs分子。构建人MT1-MMP真核表达载体(pcDNA3.1-MT1-MMP),然后转染胃癌细胞。瘦素作用后不同时间(0、6、12、24、48小时),免疫共沉淀检测瘦素对KIF1B和MT1-MMP相互作用的影响。5.瘦素受体下游信号传导分子AKT、ERK1/2、STAT3在瘦素介导KIFs调节MT1-MMP表达中的作用瘦素作用胃癌AGS细胞不同时间(0,15,30,60分钟)后,Western blot检测不同信号通路蛋白(STAT3、P-STAT3、AKT、P-AKT、ERK1/2、P-ERK1/2)的表达变化。胃癌AGS细胞分为Contro、Leptin、LY294002(p-AKT抑制剂)、U0126(p-ERK1/2抑制剂)、Cucurbitacin Ⅰ (p-STAT3抑制剂)、Leptin+LY294002、 Leptin+U0126、Leptin+Cucurbitacin Ⅰ组,Western Blot分别检测目的KIFs分子、MT1-MMP蛋白表达水平变化,细胞表面生物素化技术检测膜表而MT1-MMP表达变化。6.检测胃癌组织瘦素、MT1-MMP和KIFs表达,并分析三个分子相关性及与临床参数关系从山东大学齐鲁医院收集胃癌及癌旁组织86例,免疫组化和Western blot检测组织中瘦索、KIF1B、 MT1-MMP表达,并分析三种分子之间的关系及其与临床参数的关系。研究结果1.瘦素促进胃癌细胞侵袭体外实验表明,瘦素(0、50、100、250.500ng/ml)能够以剂量依赖方式促进胃癌细胞侵袭,而瘦素抗体(10μg/ml)能够拮抗瘦素的促侵袭作用。而瘦素(100ng/ml)能够显著诱导胃癌细胞侵袭(AGS(3.81+0.39倍,P=0.006)>MKN-45(2.76±0.23倍,P=0.005)>MKN-28(1.83±0.18倍,P=0.016)。同时瘦素(100ng/ml)也促进胃癌细胞胶原酶侵袭。2.瘦素促进MT1-MMP膜表达,进而促进胃癌细胞侵袭瘦素(100ng/ml)促进胃癌细胞MT1-MMP基因(3.01+0.48倍,P=0.010)及蛋白(3.77+0.99倍,P=0.009)表达,同时促进膜表面MT1-MMP (2.36±0.27倍,P=0.013)表达,流式细胞术结果也表明膜MT1-MMP表达上调(2.13±0.17倍,P=0.008),而瘦素抗体则抑制此过程。同时瘦素也上调胃癌细胞MMP-2表达(AGS：1.73+0.1倍,P=0.006; MKN-45:1.55±0.09倍,P=0.008; MKN-28:1.33±0.07倍,P=0.013)。3.瘦素通过上调KIF1B促进MT1-MMP膜表达,进而促进胃癌侵袭RT-PCR结果表明瘦索(100ng/ml)作用后胃癌细胞KIF3A、KIF3B、KIF5B表达无显著变化(P>0.05),而KIF1B则在基因(3.34±0.12倍,P=0.007)及蛋白(3.52±0.18倍,P=0.002)水平表达上调,瘦素抗体则拮抗此过程。利用KIF1B-siRNA干扰掉KIF1B后,发现并不影响瘦素对MT1-MMP基因(P>0.05)及蛋白(P>0.05)水平的上调作用,但是能够降低瘦素对膜表面MT1-MMP的上调作用(48.1%±4.0%,P=0.003)。瘦索诱导的胃癌细胞侵袭被MT1-MMP-siRNA(62.8%±4.5%,P=0.005)和KIF1B-siRNA (45.2%±6.5%,P=0.016)降低,二者联合降低71.]%±3.7%(P<0.001)。4.瘦素对KIF1B和MT1-MMP相互作用的影响免疫共沉淀结果发现KIF1B和MT1-MMP存在相互作用，且瘦素显著促进二者的相互作用,6小时作用不显著(P>0.05),从12小时开始增加。瘦索作用48小时后MT1-MMP表达高KIF1B,表明瘦索能够促进KIF1B对MT1-MMP的转运作用。5.瘦素受体下游ATK途径参与KIF1B及MT1-MMP表达的调节瘦素能够活化瘦素受体下游三个信号通路STAT3、ERK1/2和AKT,分别在15、30、30分钟活化达到高峰,利用通路抑制剂发现cucurbitacin I (STAT3抑制剂)并不影响KIF1B和MT1-MMP及膜MT1-MMP表达,而LY294002(AKT抑制剂)能够降低瘦素诱导的MT1-MMP (84.7%±6.8%, P=0.005)、 KIF1B (81.5%±8.5%, P=0.012)和膜MT1-MMP (76.0%±8.9%, P=0.01)的表达作用,U0126(ERK1/2抑制剂)则部分抑制瘦素诱导的MT1-MMP (53.4%±5.6%, P=0.003)、KIF1B (47.6%±4.9%, P=0.011)的表达作用,但对膜MT1-MMP表达无显著作用,表明AKT参与KIF1B依赖的MT1-MMP膜转运过程。6.胃癌组织高表达瘦素、MT1-MMP和KIF1B三者表达显著相关,且与临床分期、转移密切相关免疫组化结果表明与癌旁组织相比,胃癌组织高表达瘦素(59.3%,51/86)、MT1-MMP(63.9%,55/86)和KIF1B(68.6%,59/86),三者表达显著相关(Leptin和MT1-MMP:P<0.001; Leptin和KIF1B:P=0.039; MT1-MMP和KIF1B: P<0.001),且分别于胃癌分期和转移密切相关,表明在体内三个分子存在潜在的相互调节关系。结论1.瘦素是MT1-MMP有效的胞内活化剂,瘦素通过上调MT1-MMP促进胃癌细胞侵袭。2.瘦素促进胃癌细胞MT1-MMP膜表达过程是KIF1B依赖的,参与胃癌细胞侵袭过程。3.阐明瘦素受体下游AKT信号途径在瘦素促进MT1-MMP膜表达的作用,为早期控制胃癌侵袭提供潜在诊断、治疗策略及数据支持。意义通过本课题的研究,明确瘦素对MT1-MMP表达的调控机制及其在胃癌侵袭中的作用,从而进一步明确胃癌侵袭机制,同时也为早期控制胃癌MT1-MMP活性及侵袭提供潜在的治疗靶点。第二部分瘦素对胃癌细胞迁移的影响及机制研究研究背景胃癌是世界第二大癌症,死亡率居世界前列,脂肪细胞为肿瘤细胞快速生长提供能量,脂肪代谢紊乱能够导致胃癌的发生,因此肥胖是胃癌的危险因子之一。瘦素主要由脂肪细胞分泌,能够与瘦素受体结合后通过调节饮食摄入和能量代谢参与体内内环境稳态的平衡维持。最近研究表明瘦素也参与肿瘤的发生发展,本研究前期研究结果表明胃癌组织瘦素过表达,且与胃癌侵袭和迁移密切相关,但具体的作用及机制尚不清楚。ICAM-1分子是免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,介导细胞-细胞以及细胞-细胞外基质的相互作用。ICAM-1分子可以在肿瘤细胞侵袭周围组织过程中发挥作用,在多种肿瘤如前列腺癌、肺癌时表达上调,且参与肿瘤迁移过程。且胃幽门螺旋杆菌感染后瘦索和ICAM-1分子表达均上调,表明二者可能具有潜在的调节作用,但是确切的作用及机制尚不清楚。本课题组前期研究发现瘦索能够通过上调MT1-MMP表达促进胃癌细胞侵袭,而已有的研究也发现MT1-MMP能够凹切ICAM-1分子促进肿瘤细胞迁移,但是瘦素对ICAM-1的具体作用及其在胃癌迁移中的作用尚未阐明。综上所述,基于本领域国内外研究进展及课题组的前期研究基础,我们收集胃癌组织标本,检测瘦素和ICAM-1的表达,并分析其与临床参数的关系。然后体外观察瘦索对胃癌细胞ICAM-1表达的影响，探讨ICAM-1在胃癌细胞迁移中的作用。最后观察信号途径Rho/ROCK在瘦素对ICAM-1表达调节中的作用。本研究将进一步阐明胃癌转移机制,同时也为早期控制胃癌提供潜在治疗靶点。研究目的1.检测胃癌组织中瘦素、ICAM-1表达,并分析二者之间的关系及与临床参数的关系。2.观察瘦素对胃癌细胞迁移的影响。3.观察瘦素对胃癌细胞ICAM-1农达的影响,探讨其在瘦索调节胃癌细胞迁移中的的作用。4.阐明胃癌细胞中信号途径Rho/RPCK在瘦素调节ICAM-1表达中的作用。研究方法1.检测胃癌组织瘦素和ICAM-1表达,分析二者相关性及与临床参数关系从山东大学齐鲁医院收集石蜡包埋的胃癌组织84例,免疫组化检测组织中瘦素和ICAM-1分子的表达,进一步分析二者的相关性及其与临床参数的关系。2.瘦素对胃癌细胞迁移的影响体外实验利用胃癌细胞系AGS和MKN-45, transwell检测不同剂量瘦素(0.50、100、250、500ng/ml)37℃作用后不同时间(0、6、12、24、36小时)胃癌细胞迁移变化,计算侵袭指数,确定最佳瘦素作用浓度。3.瘦素对胃癌细胞中ICAM-1表达的影响,观察其在瘦素调节胃癌细胞迁移中的作用胃癌细胞(AGS和MKN-45)分为未处理组(Control)、瘦素(Leptin,100ng/ml)组,37℃培养24小时后,RT-PCR和western blot检测ICAM-1基因及蛋白水平表达,流式细胞术检测胃癌细胞膜表面ICAM-1表达,ELISA检测胃癌细胞培养上清中可溶性ICAM-1表达。利用ICAM-1-siRNA技术沉默ICAM-1,胃癌细胞分为Control、 Leptin+con-siRNA、Leptin+ICAM-1-siRNA组,37℃培养24小时后Transwell检测胃癌细胞迁移变化。4.信号途径Rho/ROCK在瘦素调节ICAM-1表达中的作用瘦素作用胃癌细胞不同时间(0、15、30、60分钟)后,G-LISA RhoA活化检测试剂盒检测RhoA GTPase活性,western blot检测胃癌细胞P-ROCK和ROCK表达。胃癌细胞分为Control、Leptin、C3transferase(RhoA抑制剂)、Y-27632(ROCK通路抑制剂)、Leptin+C3transferase、Leptin+Y-27632组,37℃培养24小时后。RT-PCR和western blot检测ICAM-1基因及蛋白水平表达,流式细胞术检测胃癌细胞膜表面ICAM-1表达,ELISA检测胃癌细胞培养上清中可溶性ICAM-1表达。研究结果1.胃癌组织高表达瘦素和ICAM-1,二者表达显著相关,且与临床分期、转移密切相关免疫组化分析显示胃癌组织过表达瘦素(48/84，57.1%)和ICAM-1(54/84,64.2%),二者表达显著正相关(P<0.001),且分别与临床分期及迁移紧密相关。表明在体内二个分子存在潜在的相互调节关系。2.瘦素促进胃癌细胞迁移体外实验表明,瘦素(0、50、100、250、500ng/ml)能够以时间和剂量依赖方式促进胃癌细胞(AGS和MKN-45)迁移。3.瘦素通过上调ICAM-1表达促进胃癌细胞迁移结果表明瘦索(100ng/ml)通过上调胃癌细胞ICAM-1基l因(AGS：4.06+0.54倍,P<0.001:MKN-45:2.56±0.33倍,P=0.005)及蛋白(AGS：3.07+0.25倍,P<0.001:MKN-45:2.9±0.26倍,P=0.003)表达,另外,瘦素也上调胃癌细胞表面ICAM-1(AGS:从43.65%±2.42%到78.96%±2.09%,P<0.01；MKN-45:从35.35%+1.61%到59.64%+3.51%,P<0.001)和可溶性ICAM-1表达(AGS, P<0.05;MKN-45,P<0.01).利用ICAM-1-siRNA干扰掉ICAM-1后,瘦素诱导的胃癌细胞迁移作用被ICAM-1-siRNA抑制(AGS:53.9%±3.6%,P=0.020:MKN-45:42.79%±3.78%, P=0.005).4.信号途径Rho/ROCK参与瘦素调节ICAM-1表达瘦索在15分钟(AGS：1.2+0.2倍；MKN-45：1.1±0.1倍)、30分钟(AGS：1.6+0.1倍；MKN-45：1.36±0.06倍)和60分钟(AGS：1.67+0.12倍；MKN-45：1.5+0.1倍)能够促进胃癌细胞Rho A活性。ROCK的磷酸化水平也在15、30、60分钟升高。利用通路抑制剂C3transferase(Rho抑制剂,0.25μg/ml)和Y-27632(ROCK抑制剂,3.3μM),发现瘦素通过Rho/ROCK途径上调ICAM-1蛋白表达,同时增强膜表面ICAM-1及可溶性ICAM-1表达,C3transferase和Y-27632抑制瘦素促进ICAM-1、膜表面ICAM-1、可溶性ICAM-1表达(AGS,P<0.01;MKN-45, P<0.01).结论1.瘦素是ICAM-1有效的胞内活化剂,瘦素通过上调ICAM-1表达促进胃癌细胞迁移。2.阐明Rho/ROCK信号途径在瘦索促进ICAM-1表达的作用,为早期控制胃癌发展提供潜在诊断、治疗策略及数据支持。意义本研究明确瘦素对ICAM-1表达的调控机制及其在胃癌细胞迁移中的作用,从而进一步明确胃癌发生发展相关分子机制,对发现肿瘤新的潜在治疗靶点、优化治疗方案具有重要价值和意义。