随着航天科技的发展和空间领域的开发利用,空间生命科学研究已越来越受到人们的重视。家蚕具有体积小,体重轻,生命周期短,易取材和遗传背景清楚等优点,是进行生物搭载实验,探索空间生命科学新型的理想材料。本项研究以空间生物学研究的需求出发,在综合考虑返回式卫星平台资源条件限制的基础上,开展空间环境对家蚕胚胎发育的影响与基因表达变化的研究。利用我国首颗微重力科学实验卫星—实践十号返回式科学实验卫星搭载了家蚕胚胎,对返回地面后孵化的蚁蚕进行转录组分析,对幼虫进行表型相关检测。从中挑选了比较保守的miRNA-14及基因BmTCTP,应用基因编辑技术CRISPR/Cas9进行功能研究,来探索和解释空间飞行后的胚胎发生相应变化的分子机制。本论文开展的主要研究工作和获得结果如下:(1)发射前的地面模拟。在发射前,为了模拟空间实验过程,根据家蚕胚胎的生长发育特点,利用家蚕卵(胚胎)作为试验材料,探索在模拟空间环境下的发育状况,包括密闭环境,震动等条件。在确保胚胎能够顺利孵化的前提下,摸索家蚕胚胎培养的最适条件,包括温度、湿度、气压、氧气供给等条件。鉴于实践十号卫星在轨周期为12天,回收样品及地面准备时间为1-3天,而24-25℃情况下蚕卵10天即可孵化,因此将在轨时的温控要求至21-22℃。为家蚕胚胎在轨实验的顺利进行提供了重要的参考。(2)空间飞行后家蚕的胚胎发育进程研究。家蚕培养箱按照发射场要求,在发射场进行了装样工艺验证、协同转运演练、匹配试验和发射场整星电测工作。家蚕培养箱于2016年4月4日完成了样品加载,于4月5日完成发射前家蚕样品装样和塔架转运交付工作。在飞行阶段家蚕培养箱,按照在轨实验流程完成了12天15小时的在轨实验,实现了空间密闭家蚕培养和5个培养单元的家蚕多温区低温固定,并首次成功获取了空间家蚕胚胎发育过程的图像。空间环境下培养的家蚕胚胎返回地面后可以正常孵化,能够完成幼虫生长发育、吐丝结茧、化蛹、羽化、交配、产卵等行为,但在幼虫发育过程中,生长发育时间缩短3天。这为后续的基因表达谱研究提供了理想表型。(3)全基因组基因表达谱。家蚕胚胎返回地面孵化后,将空间环境培养的胚胎、地面对照组21℃培养的胚胎,和地面对照组24℃培养的胚胎孵化后的蚁蚕进行转录组测序。结果表明,与地面对照组21℃相比较,差异表达的基因主要富集在代谢通路、胰蛋白酶分泌、蛋白消化与吸收的通路中;空间飞行组与地面对照组24℃相比较,显著差异表达基因主要富集在的胰蛋白酶分泌、蛋白消化与吸收、半乳糖代谢通路中。为了避免因为空间环境和地面环境温度的差异造成基因表达变化,因此,从这两组差异表达的基因中,筛选出仅在空间飞行组和地面对照组21℃中具有显著性差异变化的基因,这些基因主要富集在代谢通路中。同时,在这些显著性差异表达的基因中,有很多表皮蛋白家族基因也发生显著性变化。这说明,空间环境可引起家蚕胚胎代谢调节及对家蚕胚胎表皮有一定的影响。(4)基因功能研究miRNA-14的功能研究。microRNA(miRNA)调节昆虫的多种生理过程,包括发育和变态。miRNA-14(miR-14)是无脊椎动物中比较保守的非编码RNA。在空间飞行组和地面对照组中,miR-14的表达显著下调。利用GAL4/UAS转基因双系统全身过表达miR-14,转基因家蚕表现为幼虫和蛹的身体尺寸减小,蜕皮激素滴度下调显著。相反,使用CRISPR/Cas9转基因双系统敲低miR-14,转基因家蚕的幼虫发育时间缩短3天,提前上蔟化蛹,此表型与空间环境下培养的胚胎孵化后的幼虫表型一致;miR-14敲低后蜕皮激素浓度升高,此表型与miR-14过表达的表型一致。通过生物信息软件PITA、miRanda、microTar进行靶基因预测,同时基于miR-14过表达和敲低的表型,将E75和EcR-B作为miR-14的假定靶基因。在哺乳动物HEK293T细胞系中用双荧光素酶报告系统分析,证实了miR-14能够抑制E75和EcR-B的荧光素酶活性;而E75和EcR-B的mRNA水平在miR-14过表达家蚕中显著下调,在miR-14敲低的转基因家蚕中显著上调;此外,蜕皮激素通路中的其它基因BRC、HR3、FTZ-F1等在过表达和敲低转基因家蚕中均受到显著影响。所有数据表明,在家蚕中,miR-14是维持蜕皮激素稳态以促进家蚕正常发育和变态的一个重要调节因子。由于miR-14敲低表型与空间环境培养后孵化的幼虫表型一致,且miR-14在空间环境培养的胚胎中显著下调,因此,推测空间环境可能对家蚕的蜕皮激素稳态有一定的影响。基因TCTP的功能研究。翻译调节肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP),是一个在物种间广谱表达且结构非常保守的亲水性蛋白,在真核生物包括酵母、真菌、哺乳动物、昆虫、植物中均有表达。目前研究表明,TCTP具有调节细胞骨架动态变化、细胞生长、增值和凋亡、保护细胞免受多种应激损伤等多种功能。也有报道TCTP基因对电离辐射非常敏感。在空间环境培养的胚胎孵化后的蚁蚕中,与地面对照组相比,BmTCTP基因的表达显著性上调。为了阐明BmTCTP基因在家蚕中的功能,首先检测了BmTCTP的组织表达和时期表达模式,和其它昆虫一样,BmTCTP基因在家蚕生命的各个龄期、各个组织表达量都较高,说明BmTCTP在家蚕中有着重要的生物学功能。接着,利用转基因CRISPR/Cas9双系统定点敲低BmTCTP,其突变导致家蚕幼虫在三龄第一天开始身体尺寸变小,体重变轻,且在三龄蜕皮期间相继死亡。经解剖发现,BmTCTP的敲低同时也导致家蚕的主要组织包括中肠、丝腺、外生殖器变小,且解剖时组织极易破碎;经过石蜡切片发现,突变体的中肠横截面明显小于野生型,用HE染色可观察到BmTCTP敲低突变影响家蚕中肠的主要结构(肌肉层、基底膜、上皮细胞)。利用扫描电镜观察围食膜,突变体家蚕围食膜表面平滑,有小缝和微孔,而野生型家蚕围食膜呈波状,表面紧致,无孔缝和小孔。通过Hoechst 33258、DiI染色,可观察到家蚕重要组织脂肪体细胞变小。RNA-Seq和qPCR分析表明在BmTCTP的敲低突变体中,碳水化合物代谢、脂质代谢、和消化系统途径失调,从而导致家蚕幼虫发育和生长出现了缺陷。综上所述,本论文首次利用卫星实现了在空间条件下对家蚕胚胎的培养,首次获取了空间条件下家蚕胚胎发育过程的图像,首次利用高通量技术对空间培养的家蚕胚胎所发育的幼虫进行基因表达分析,并从中选取基因和非编码RNA进行了功能分析。研究空间环境对家蚕胚胎发育的影响将成为载人太空探索的组成部分,同时也有利于空间昆虫生物学的发展。