肺瘤平膏及其联合用药调控肺转移微环境防止肺转移的机制研究

来源 :北京中医药大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:xjl002
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研究背景:转移是导致大多数肿瘤患者临床治疗失败和死亡的主要因素。研究认为肿瘤微环境可以改变肿瘤转移的潜能,微观整体性调控肿瘤微环境防治肿瘤越来越受到重视。肿瘤微环境是指肿瘤及其所处的外部环境,实际是一个复杂的动态网络,以肿瘤实体为参照,肿瘤微环境可机械的分为肿瘤核心微环境、肿瘤侵袭微环境、肿瘤转移微环境。既往中医药集中在瘤体(肿瘤核心微环境)方面的研究,而对非癌组织(转移微环境)的方面的研究欠缺。理论上整体性调节肿瘤微环境应具有广谱、双向、低毒、高效的特点。中药正是由于上述治疗特点常被长期单独应用或者联合应用于肿瘤预防与治疗中。临床实践与研究表明,长时间的服用中药具有预防肿瘤复发转移的优势,而就目前的研究情况来讲,联合用药防治肿瘤由于疗效增加而备受青睐。抗炎药的毒副作用或者费用均远远低于靶向药、化疗药,也多处于预防和联合治疗层面,但至今为止,关于中药与抗炎药联合应用预防肿瘤转移方面的实验研究鲜有报道。基于此,本研究通过建立Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤模型,研究中药作用时间对荷瘤小鼠肺转移微环境(荷瘤小鼠肺组织)的分子机制,实验选择了具有明确抗肿瘤、以及预防转移效果的药物肺瘤平膏、塞来昔布(Celecoxib)、环磷酰胺开展研究。研究目的:研究肺瘤平膏及其联合不同类别药物(化疗药、抗炎药),特别是联合抗炎药(Celecoxib)调控肺转移微环境的分子机制。研究方法:(1)建立Lewis肺癌C57BL/6小鼠移植瘤模型、通过小动物活体成像技术与定期取材两种方法,观察肺瘤平膏及其联合不同类别药物对移植瘤以及肺转移的时间、剂量依赖性作用;(2)通过基因芯片技术,筛选肺瘤平膏对肺转移微环境作用的核心关键基因,并以此构建基因信号转导网络;(3)Western blot、免疫组化法对第(2)步骤产生的肺转移徽环境中的关键基因进行验证,并研究肺瘤平膏联合不同类别药物对不同阶段(14d、21d、28d)关键分子蛋白表达量的影响,并对其介导的下游基因以及转移相关分子进行研究;(4)根据步骤(3)的结果,通过Western blot、免疫组化法,研究肺瘤平膏联合Celecoxib对COX-2介导的肺转移微环境防止肺转移的分子机制;研究结果:(1)小动物活体成像结果显示:FLP-L组、FLP-M组可以明显抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr (P<0.05); FLP-M组其抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr的效果最好;FLP-H组并没有显示出抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr的作用(P>0.05); FLP联合不同类别药物方面:第7d、14d、21d、28d进行活体成像时,FLP+CTX组、FLP+CLB组具有协同或者叠加效应抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr (P<0.05),其中第7d时,FLP+CLB组与CLB组抑制小鼠瘤体p/sec/cm2/sr相比较无统计学差异(P>0.05)。(2)抑瘤率:定期(14d、21d、28d三个阶段)处死小鼠,获取瘤体称重进行计算抑瘤率:在14d、21d、28d时,FLP-L组、FLP-M组、FLP-H组抑瘤率分别为:4.9%、12.7%、6.9%;28.1%、37.9%、24.6%;14.7%、24.6%、13.5%。在14d、21d、28d时,FLP+CTX组、FLP+CLB组抑瘤率分别为:42.2%、62.3%;79.6%、58.7%;67.7%、29.8%。(3)肺转移方面:研究结果证实在14d时,各组未发生肺转移灶。21d时,开始形成微小转移灶,并伴有大量的炎性细胞浸润,28d时,转移灶变大,内部实变,伴有大量的炎性细胞浸润。在21d、28d时,肺转移发生率方面:Cor trol组、FLP-M组、FLP+CTX组、FI P+CLB组分别为50%、30%、20%、20%;80%、50%、20%、20%;肺转移灶总数方面:肺转移发生率方面:Control组、FLP-M组、FLP+CTX组、FLP+CLB组分别为23个、15个、7个、8个;36个、19个、11个、8个;肺转移抑制率方面:34.7%、69.6%、65.2%;47.2%、69.4%、69.4%;从抑制肺转移率提高的程度分析,FLP-M组提高的程度最大,FLP-M组:CTX组:CLB组=12.5%:9.4%:11.3%。(4)基因表达谱芯片筛选出1068个差异基因,其中下调基因713个,上调基因355个,下调基因中差异在2倍以上的为67个基因,而上调基因中未见差异在2倍以上的基因,通过差异基因找出了显著、准确的信号通路,其中NF-kappaB signaling pathway和PI3K-Akt signaling pathway是本次实验关注的信号通路。在104个关键基因中构建的信号转导网路研究中,可以看出基因Prkca、Mapk10、Pik3r2、Plcd1、Nfkb1是中介能力比较强的基因,在整个Signal-Net中处于一个关键节点的位置。(5)肺转移微环境中关键调控因子PI3K/AKT/NF-kB表达的研究:免疫组化结果表明:肺转移微环境中:Control组的PI3K、AKT、NF-kB表达均随时间延长有不同程度的升高,而治疗组中PI3K、AKT、NF-kB的表达均有所下降。Western blot结果表明:在14天时(转移前微环境):FLP组可以抑制PI3K、AKT、 NF-kB蛋白表达,但无统计学差异(P>0.05); FLP+CLB组可以明显抑制AKT、NF-kB蛋白表达(P<0.05)。在21d时(转移后微环境):FLP组可以明显抑制PI3K蛋白表达(P<0.05); FLP+CLB组可以明显抑制PI3K、AKT、NF-kB蛋白表达(P<0.05);在28d时(转移后微环境):FLP组未见抑制PI3K、AKT、NF-kB蛋白表达(P>0.05), FLP+CLB组可以明显抑制PI3K、AKT蛋白表达(P<0.05)。(6)肺瘤平膏及其联合Celecoxib调控COX-2介导的肺转移微环境防止肺转移的研究:Western blot结果显示:肺转移微环境中:14d时,FLP+C组可以明显抑制COX-2蛋白表达(P<0.05); 21、28d时,FLP组、FLP+CLB组可以明显抑制COX-2蛋白表达(P<0.05)。28d时:FLP组可以抑制VEGF、PDGFR-p蛋白表达,但无显著性差异(P>0.05); FLP组可以上调E-Cadherin蛋白表达,无显著性差异(P>0.05),FLP组可以明显抑制N-Cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白表达(P<0.05), FLP+CLB组与FLP组、CLB组相比较,其上调E-Cadherin蛋白表达或者抑制VEGF、PDGFR-βN-Cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白表达明显优于单药组(P<0.05)。研究结论:(1)肺瘤平膏中剂量抑瘤率最佳,随时间延长,肺瘤平膏提高抑制肺转移率的比例最佳;在联合用药方面,肺瘤平膏联合塞来昔布具有抑制肺转移的优势。(2)肺瘤平膏在调控肺转移微环境网络调节中下调基因具有明显的优势,以下调Prkca、Mapk10、Pik3r2、Plcd1、Nfkbl为核心,调节整个基因网络的平衡。(3)肺瘤平膏联合塞来昔布可明显抑制肺转移微环境PI3K-AKT-NF-KB-COX-2分子,并且可能存在时间依赖性。(4)肺瘤平膏联合塞来昔布具有协同调控EMT、血管生成、ECM等与转移相关分子的作用。
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