论文部分内容阅读
目的:建立糖尿病膀胱(DCP)动物模型,动态观察小鼠体重、饮水量、排尿量、排尿频率、膀胱结构、功能及病理指标在糖尿病膀胱中变化情况,观察Myosin Va、SLC17A9在疾病发展中的变化,探究其病程发展可能存在的分子机制。小鼠灌胃给药缩泉丸(Suo Quan Wan,SQW),观察小鼠膀胱结构、功能变化,探究缩泉丸(SQW)对糖尿病膀胱过度活动的治疗作用,并观察缩泉丸对小鼠膀胱Myosin Va和SLC17A9的影响,探讨缩泉丸对糖尿病膀胱过度活动治疗作用的可能分子机制。方法:1.糖尿病膀胱模型的建立及动态观察(1)动物模型建立STZ+高脂饲料造糖尿病模型,C57BL/6J雄性小鼠适应性喂养,正常组给与普通饲料,模型组高脂饲料。模型组小鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(1OOmg)四次造模糖尿病。造模成功后,分别在造模成功OW、3W、6W、9W、12W对小鼠进行检测。(2)一般指标观察动物造模成功后于OW、3W、6W、9W、12W检测小鼠体重、饮水量、尿量、排尿频率、空腹血糖和糖耐量。(3)尿动力指标观察尿动力学方法动态检测小鼠膀胱最大压、膀胱最大容量、非排尿收缩次数、残余尿量、排尿效率及膀胱顺应性。(4)膀胱结构的动态观察采用HE及MASSON染色法动态观察膀胱结构的变化情况。(5)膀胱离体逼尿肌功能的观察离体组织灌流系统动态检测离体膀胱肌条的自主收缩情况及离体肌条对α,β-meATP、Carbachol、KCl、EFS等外源性物质诱发的离体肌条舒缩反映情况。(6)膀胱Myosin Va及SLC17A9表达变化获取小鼠膀胱,采用western blot、RT-PCR方法检测小鼠膀胱中Myosin Va及SLC17A9蛋白表达情况。2.缩泉丸对糖尿病膀胱治疗作用观察(1)给药及一般指标观察根据1中结果确定造模方法及病程发展情况确定糖尿病膀胱过度活动发生时间。选用相同方法造模,造模成功后将其分成模型组、阳性组(托特罗定)、缩泉丸高剂量组、缩泉丸中剂量组及缩泉丸低剂量组,造模成功3W时开始灌胃给药,造模成功6W时观察缩泉丸对糖尿病膀胱一般指标的影响。(2)缩泉丸对尿动力学指标检测的影响采用尿动力学方法检测缩泉丸对小鼠膀胱最大压、膀胱最大容量、非排尿收缩次数、残余尿量、排尿效率及膀胱顺应性的影响。(3)缩泉丸对膀胱结构的影响采用采用HE及MASSON染色法观察缩泉丸对膀胱结构的影响。(4)缩泉丸对膀胱离体逼尿肌功能的影响离体组织灌流系统观察缩泉丸对膀胱逼尿肌功能的影响。(5)缩泉丸对Myosin Va及SLC17A9表达的影响采用western blot和RT-PCR方法观察缩泉丸对其表达量的影响。结果:1.糖尿病膀胱模型的建立及动态观察模型组非排尿收缩次数先增加后减少,且3-9W显著高于正常组,6W时达到峰值。模型组膀胱最大压先增加后减少,12W时显著低于正常组。病理结果显示模型组膀胱重及膀胱重与体重比在3-12周显著高于正常组。模型组膀胱壁厚显著高于正常组且呈持续上升;平滑肌-胶原比率无明显差异。离体结果表明,模型组收缩幅度3W、6W时与正常组相比显著增加,12W显著减小。加入ATP后,模型组6W、9W与正常组相比显著增加,12W时显著减小。模型组6W时,在10-6 M、3*10-6 M、1*10-5 M浓度显著升高,9W时则是3*10-6 M、1*10-5 M浓度显著升高,而12W时浓度为3*10-6M、1*10-5 M浓度显著降低,其他无显著性差异。模型组6W给与16、32、64Hz时肌条收缩张力显著高与正常组;9W模型组给与8、16、32、64Hz时肌条收缩张力显著高与正常组;而12W时模型组在8、16、32、64Hz时肌条收缩张力显著低于正常组。模型组6W时Myosin Va蛋白量及mRNA水平显著高于正常组,12W时显著低于正常组。模型组SLC17A9在6-12W时显著高于正常组,其mRNA表达在6W、9W时显著高于正常组。2.缩泉丸对糖尿病膀胱的作用与正常组比较,模型组体重、排尿效率显著降低,模型组24h饮水量、尿量空腹血糖、糖耐量、曲线下面积,非排尿收缩次数、最大膀胱容量、残余尿量、膀胱顺应性显著增加。与模型组比较,阳性组及缩泉丸高、中、低剂量组非排尿收缩次数显著减少;缩泉丸中剂量组最大膀胱容量显著减少;阳性组和缩泉丸中剂量残余尿量显著减少;,缩泉丸中剂量膀胱顺应性显著减少;阳性组及缩泉丸中剂量排尿效率显著增加。与正常组比较,模型组在给与四种不同外源性物质刺激,其中加入ATP;电刺激在32Hz、64Hz;CCH在10-7-10-5M时,模型组膀胱肌条收缩反应显著增加。与模型组相比,阳性组、缩泉丸高、中剂量组加入ATP后肌条收缩反应显著减少;阳性组、缩泉丸中剂量组加入KCL后收缩反应显著减少;32Hz及64Hz的电场刺激时缩泉丸中剂量显著降低;10-5M浓度CCH时阳性阻肌条收缩反映显著降低,给与10-7-10-5M浓度时缩泉丸低剂量组肌条收缩反应显著减少。与正常组比较,模型组Myosin Va、SLC17A9蛋白及mRNA表达显著升高;与模型组相比,缩泉丸给药组Myosin Va蛋白及表达显著降低。缩泉丸中剂量组SLC17A9显著降低。结论:缩泉丸可明显改善糖尿病过度活动,其机制可能是通过降低膀胱内Myosin Va与SLC17A9过表达,降低因ATP的释放增加导致的平滑肌收缩,从而改善糖尿病膀胱过度活动期的不稳定收缩,改善其过度活动症状。