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WRKY转录因子在逆境胁迫方面有十分重要的作用。以拟南芥AtWRKY44基因为探针,同源克隆大豆的GmWRKY148基因编号(Glyma.14G199800),并进行生物信息学分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的不同组织和接种大豆疫霉不同时间点的转录水平;利用酶切连接方法将GmWRKY148的完整的CDS序列构建到植物过表达载体pBINGFP2中,获得OE-GmWRKY148;利用发根农杆菌介导的遗传转化体系,获得阳性转化根,接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况,证实其是否参与大豆与大豆疫霉菌的互作。主要研究结果如下:1.大豆中拟南芥AtWRKY44的同源基因的诱导表达分析以拟南芥AtWRKY44(AT2G372601)为探针,利用Phytozome(http://www.Phytozome.net/)进行BLAST比对,查找大豆中与之同源的基因。结果发现同源基因数量较多,选择得分≥100的GmWRKY基因。使用大豆疫霉菌P6497接种大豆栽培品种Williams(感)和Williams82(抗),根据这些GmWRKY基因的表达情况,选择接种前后表达量差异较大的GmWRKY148基因,进行克隆和功能验证。2.大豆GmWRKY148的克隆在大豆中,拟南芥AtWRKY44的同源基因数量较多,经过大豆疫霉菌P6497的诱导,选择了表达量变化较大的基因,GmWRKY148。从Williams 82的根中克隆得到GmWRKY148基因。结果显示其cDNA全长为1328 bp,包括999 bp的CDS序列、249 bp的5’非编码区和80bp的3’非编码区,此基因编码含332个氨基酸的多肽,等电点是7.61。3.GmWRKY148的蛋白质结构、启动子和系统进化分析GmWRKY148蛋白质三级结构包含7个α-螺旋,4个β-折叠;启动子区域包含MBS、TC-rich repeats、TCA-element、GARE-motif等多种逆境胁迫应答元件。系统进化分析表明,GmWRKY148蛋白与豆科植物的基因亲缘关系十分相近。4.GmWRKY148组织特异性表达和受疫霉菌侵染诱导表达组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。接种大豆疫霉P6497后,在大豆Williams(感)和Williams 82(抗)中,GmWRKY148的表达呈现总体上调表达的趋势,但在Williams 82中上调倍数更高。5.GmWRKY148基因的亚细胞定位分析通过在线网站预测GmWRKY148蛋白很可能定位于细胞核中,从而调节相应基因的表达。将GmWRKY148的CDS序列与GFP蛋白相融合构建pBIN-GmWRKY148-GFP载体。结果说明,GmWRKY148是一个核定位蛋白。6.GmWRKY148基因增强大豆对疫霉菌的抗性对转OE-GmWRKY148和空载体(EV)的阳性发状根分别接种疫霉菌丝块,比较接种24h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示:转OE-GmWRKY148发状阳性根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对转OE-GmWRKY148和EV的阳性发状根分别接种疫霉菌游动孢子,并在接种后24h、36h和48h显微观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示:OE-GmWRKY148与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。结果表明,GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。