糖尿病肾病（Diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者最重要的致死性微血管合并症之一，主要是伴随蛋白尿产生、肾小球率过滤增加、血尿素氮和肌酐浓度增高、肾小球硬化等病理特征的慢性代谢性疾病。糖尿病肾病也是导致终末期肾病的主要原因。事实上，糖尿病肾病主要是指糖尿病性肾小球硬化症，是一种以微血管受损为重要特征的肾小球病变。肾小球内皮细胞是组成肾小球的主要细胞之一，主要保障肾小球毛细血管的滤过作用及原尿生成。由于肾小球内皮细胞直接与血液接触，因此可直接受到高血糖的影响。研究证实，肾小球内皮细胞受损是引起肾小球系膜细胞病变及肾小球硬化的始发因素，与糖尿病肾病的发生发展密切相关。而细胞凋亡是肾小球细胞受损的一个重要标志，已有研究发现糖尿病或高糖刺激导致肾小球系膜细胞、足细胞及内皮细胞凋亡，但有关糖尿病肾病时肾小球内皮细胞凋亡的确切机制尚不清楚。　　Swiprosin-1是2004年首次报道发现的分子量约为27KD的一种新型钙结合蛋白，截至目前pubmed检索仅有20篇相关文献报道，并主要集中在免疫细胞及其信号转导机制、神经系统疾病等研究领域。近年来，我们课题组也围绕swiprosin-1进行一些探索性研究，结合文献检索，我们证实了不管是啮齿类动物如大鼠、小鼠，还是灵长类动物如人、食蟹猴等的肾小球中都有swiprosin-1的表达和分布。进一步应用免疫组织化学技术发现swiprosin-1在肾组织中的肾小球内皮细胞有适度表达。随后，我们通过对I型糖尿病模型小鼠的研究发现，随着造模时间的增长，尿蛋白水平不断增加，肾小球滤过率降低，而swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达不断增加，并伴随肾小球内皮细胞凋亡数目的上升。因此，我们推测肾小球内皮细胞特异性表达的 swiprosin-1可能与肾小球内皮细胞凋亡相关，从而影响糖尿病肾病的发生发展。　　本课题以swiprosin-1为中心，试图阐明swiprosin-1在糖尿病肾病发生和发展中的作用，确定高糖环境下swiprosin-1对肾小球内皮细胞凋亡的影响作用及机制，为进一步明确swiprosin-1作为一个新型的抗糖尿病肾病药物靶点奠定基础。根据此目的，我们进行了相应的实验。具体实验方法和结果如下：　　一、Swiprosin-1在肾小球内皮细胞中表达　　1.应用免疫组织化学技术发现swiprosin-1在小鼠、食蟹猴等动物肾小球有表达分布。　　2.应用免疫荧光组织化学技术发现swiprosin-1在小鼠肾小球内皮细胞中有表达分布。　　3.应用免疫荧光细胞化学技术发现swiprosin-1在人肾小球内皮细胞中有表达，并主要分布在细胞浆。　　二、糖尿病或高糖刺激上调肾小球内皮细胞 swiprosin-1的表达及其凋亡数目　　1.单剂量注射链脲佐菌素诱导C57BL/6小鼠糖尿病肾病，在第16w检测小鼠各项指标，与对照组相比血糖升高[(30±2.89)mM vs(6.6±0.29)mM，P<0.01]，肾比重增加[(14.8±0.47)×10-3 vs(11.3±0.11)×10-3，P<0.001]，尿蛋白升高[(369.7±15.39)mg/L vs(240.8±10.82) mg/L,P<0.01]，体重下降[(25.1±0.71)g vs(28.7±0.81)g,P<0.01]，肾小球滤过率下降[(50.4±0.51)μg/L vs(67.6±9.86)μg/L, P<0.05]。　　2.链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠肾皮质中swiprosin-1表达在第8、16w显著性增加。　　3.免疫荧光组织化学技术验证糖尿病肾病小鼠的肾小球内皮细胞中swiprosin-1表达明显增加，并伴随其凋亡数目的增多。　　4.体外给予人肾小球内皮细胞高糖刺激，葡萄糖浓度为11mmol和33mmol时均可显著性增加 swiprosin-1的表达，刺激时间为24、48、96h可显著性增加 swiprosin-1的表达。　　5.体外给予人肾小球内皮细胞高糖刺激24、48、96h可显著性降低细胞增殖活力，增加细胞毒力。　　三、动物水平上验证敲除swiprosin-1后可减少糖尿病引起的肾小球内皮细胞凋亡　　单剂量注射链脲佐菌素诱导swiprosin-1-/-和swiprosin-1+/+小鼠糖尿病肾病后，应用免疫组织荧光化学技术发现swiprosin-1-/-组糖尿病肾病小鼠中肾小球内皮细胞的凋亡数明显低于swiprosin-1+/+组。　　四、Swiprosin-1促进高糖诱导的肾小球内皮细胞凋亡　　1.Swiprosin-1过表达慢病毒转染人肾小球内皮细胞，增加swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达，可显著性降低人肾小球内皮细胞的增殖活力，增加核固缩细胞数目及细胞凋亡率。　　2.Swiprosin-1干扰慢病毒转染人肾小球内皮细胞，减少 swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达，对肾小球内皮细胞的增殖活力、细胞核固缩程度及细胞凋亡率没有影响。给予高糖刺激后，对照组的细胞增值活力显著性降低，核固缩细胞数和细胞凋亡率均显著性增加。然而干扰组的细胞增殖活力、核固缩及凋亡率均未受到高糖影响。　　五、高糖通过PKCβI信号通路上调swiprosin-1的表达　　1.链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠肾皮质内PKCβI和swiprosin-1的表达均显著性增加。给予糖尿病肾病小鼠LY333531治疗8w后，其肾皮质中PKCβI和swiprosin-1的表达显著性降低。　　2.免疫荧光组织化学实验验证给予糖尿病肾病小鼠PKCβI抑制剂治疗8w后，肾小球内皮细胞中swiprosin-1表达及其凋亡数目均明显减少。　　3.体外高糖刺激，给予人肾小球内皮细胞PKCβI抑制剂处理96h后，细胞内PKCβI和swiprosin-1的表达减少。　　4.体外高糖刺激，激动PKCβI的作用使人肾小球内皮细胞增殖活力降低，而抑制PKCβI的作用对细胞增殖活力没有影响。然而，体外高糖刺激，PKCβI抑制剂可抑制高糖降低细胞增殖活力的作用。　　六、Swiprosin-1促进肾小球内皮细胞凋亡的作用机制　　1.Swiprosin-1慢病毒转染人肾小球内皮细胞，增加swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达，可显著性升高激活型caspase3、caspase9和促凋亡蛋白bax的表达。干扰swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达，不影响caspase9等促凋亡相关蛋白的表达。体外高糖刺激，干扰swiprosin-1的表达可以抑制高糖诱导的激活型caspase3、caspase9和促凋亡蛋白 bax表达的上调。　　2.Swiprosin-1慢病毒转染人肾小球内皮细胞，增加swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达后，caspase9的活性升高。干扰swiprosin-1在肾小球内皮细胞的表达，不影响caspase9的活性，但给予高糖刺激后，干扰组的caspase9的活性较对照干扰组明显降低。　　3.Swiprosin-1过表达慢病毒转染增加 swiprosin-1在人肾小球内皮细胞的表达后，应用免疫细胞荧光化学发现细胞色素C的释放明显增加。　　4.Swiprosin-1过表达慢病毒转染增加swiprosin-1在人肾小球内皮细胞的表达后，应用免疫沉淀技术发现swiprosin-1/pro-caspase9复合体和Apaf-1/pro-caspase9/Cyt-c复合体的含量均明显增加。　　结论　　1.Swiprosin-1介导高糖诱导的肾小球内皮细胞凋亡；　　2.高糖刺激增加PKCβI的表达，可上调swiprosin-1的表达水平，促进细胞色素C释放，激活caspase9和caspase3，引发肾小球内皮细胞凋亡；　　3.Swiprosin-1缺失可减少糖尿病小鼠早期肾小球内皮细胞的凋亡，延缓糖尿病肾病的发展。