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高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV）是危害人类健康、养殖业发展和公共卫生安全的重要病原体之一,被我国传染病防治法列为乙类传染病,按照甲类传染病管理。根据世界卫生组织（World health organization,WHO）统计,从2003年至2022年3月1日,全球累计人感染H5N1病例超过864例,死亡456例,病死率接近53%。人感染H5N6病例共计66例,死亡29例,病死率超过43%。近年来,人感染高致病性H5亚型禽流感影响包括我国在内的世界多个国家和地区,引发高度关注。目前,人用H5禽流感商品化疫苗较少。流感减毒疫苗具有使用鼻喷接种,并能够诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫等优势。但是,由于使用的是活病毒,可能与自然界流行株发生重配和重组的风险,引发一定的安全担忧。因此,研发新型人用H5亚型禽流感病毒减毒疫苗具有重要公共卫生意义。为此,本研究构建了基于B型流感病毒冷适应骨架株,表达HPAIV H5N1和H5N6表面HA蛋白的人用H5禽流感减毒疫苗候选株,并在小鼠和雪貂动物模型上进行安全性、免疫原性和攻毒保护评价,为研发新型人用H5亚型禽流感减毒活疫苗提供了新的思路。1.B型流感病毒冷适应株反向遗传操作系统的构建及鉴定反向遗传技术是快速构建流感减毒疫苗的技术平台。本实验部分构建了一株B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/1999（简称BV99）的8质粒反向遗传操作系统,将BV99株8个重组质粒共同转染293T细胞和MDCK细胞,进行病毒拯救,并鉴定基本生物学特性。实验结果显示,成功扩增出BV99株的8个基因片段且测序正确。拯救病毒株血凝效价为2~6,在电镜下可观察到流感病毒样粒子。拯救病毒株在MDCK细胞上复制良好。不同温度（27℃,33℃和39℃）下病毒滴度结果显示,拯救病毒株具有冷适应特性和温度敏感特性。拯救病毒株在小鼠肺脏病毒载量低。本部分实验内容表明,成功构建了B型流感病毒冷适应株B/Vienna/1/1999株的反向遗传操作系统,经分子生物学、形态学等鉴定正确,拯救病毒株具有冷适应特性、温度敏感特性、减毒特性,为H5亚型禽流感病毒冷适应疫苗构建提供了平台。2.2.3.2.1分支H5N1和2.3.4.4分支H5N6冷适应疫苗候选株的构建及鉴定2.3.2.1分支和2.3.4.4分支H5亚型禽流感病毒是我国近年主要流行分支。本部分基于B型流感病毒冷适应株反向遗传平台,将改造后H5N1、H5N6禽流感病毒HA蛋白胞外区插入到BV99株骨架中,分别构建了1株2.3.2.1分支H5N1和4株2.3.4.4分支H5N6禽流感病毒的疫苗候选株,并进行基本生物学特性鉴定。实验结果显示,成功扩增出H5流感疫苗候选株8个基因片段且测序正确。电镜下观察到流感病毒样粒子,血凝效价达到2~6-2~7。H5流感疫苗候选株在MDCK细胞上生长良好。不同温度（27℃,33℃和39℃）病毒滴度结果显示,H5流感疫苗候选株具有冷适应特性和温度敏感特性。本部分实验内容表明,成功构建了基于B型流感病毒冷适应骨架株的2.3.2.1分支H5N1和2.3.4.4分支H5N6冷适应疫苗候选株,具有生长特性良好、冷适应特性、温度敏感特性、遗传稳定性等特点,为后续动物免疫及攻毒评价打下了基础。3.2.3.2.1分支H5N1冷适应疫苗候选株实验免疫研究疫苗的动物免疫原性和攻毒保护评价是疫苗研发中必要环节。本部分对构建的2.3.2.1分支H5N1冷适应疫苗候选株进行了实验免疫研究,分别采用单剂量免疫和两剂量免疫方式,全面评估小鼠免疫反应并进行攻毒保护评价。H5N1冷适应疫苗候选株在小鼠肺脏病毒载量较低。免疫小鼠血清中可以检测到一定水平的血凝抑制抗体、中和抗体、血清Ig G结合抗体,并且两剂量免疫组小鼠高于单剂量免疫组小鼠。免疫小鼠肺灌洗液中检测到一定水平的黏膜Ig A抗体。免疫小鼠脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌显著增加的IFN-γ细胞因子,诱导机体产生了特异性细胞免疫应答。免疫小鼠经同源2.3.2.1分支H5N1野毒株攻毒后,小鼠存活率为100%。以上实验结果表明,构建的2.3.2.1分支H5N1冷适应疫苗候选株对小鼠安全性良好,免疫小鼠后可以产生特异性的体液免疫反应、黏膜免疫反应和细胞免疫反应,可以抵抗同源2.3.2.1分支H5N1野毒株的致死性攻击。4.2.3.4.4分支H5N6冷适应疫苗候选株实验免疫研究雪貂动物模型是WHO推荐的用于流感疫苗评价的理想模型。本部分对构建的4株2.3.4.4分支不同group H5N6冷适应疫苗候选株进行了实验免疫研究。分别采用单剂量免疫和两剂量免疫方式,全面评估小鼠免疫反应并进行交叉保护攻毒评价。选择有代表性的2.3.4.4b和2.3.4.4h分支H5N6冷适应疫苗候选株进行雪貂模型免疫实验,并进行交叉攻毒保护评价。实验结果显示,4株2.3.4.4分支不同group H5N6冷适应疫苗候选株对小鼠致病性较低。免疫小鼠血清可以检测到一定水平的HI抗体、中和抗体和Ig G结合抗体,两剂量免疫组小鼠抗体水平高于单剂量免疫组。免疫小鼠肺灌洗液中可以检测到特异性的黏膜Ig A抗体。免疫小鼠脾细胞中CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌显著增加的IFN-γ细胞因子,诱导机体产生了特异性细胞免疫应答。两剂量免疫小鼠经2.3.4.4分支H5野毒株攻毒后生存率为100%。2.3.4.4b和2.3.4.4h H5N6冷适应疫苗候选株对雪貂致病性低。免疫雪貂血清中可以检测到一定水平的HI抗体、中和抗体和Ig G结合抗体,脾细胞特异性IFN-γ细胞因子分泌增加,雪貂攻毒后,可以产生交叉保护。本部分实验结果表明,4株2.3.4.4分支不同group H5N6冷适应疫苗候选株在小鼠体内安全性良好,可诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应、黏膜免疫反应和细胞免疫反应,对2.3.4.4分支H5野毒株产生交叉保护。2.3.4.4b和2.3.4.4h H5N6冷适应疫苗候选株在雪貂上安全性良好,诱导雪貂产生特异性的体液免疫反应和细胞免疫反应,对2.3.4.4分支H5野毒株产生交叉保护。本研究构建的基于B型流感病毒冷适应骨架株的人用H5N1和H5N6禽流感病毒减毒疫苗株,具有不与自然界H5流行株重配的优势,能够诱导产生多种免疫反应应答,为研发新型人用高致病性H5亚型禽流感疫苗奠定了基础。