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头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC,简称头颈鳞癌)是头颈部恶性肿瘤的主要病理类型,约占所有头颈部肿瘤的90%,且发病率呈现逐年上升趋势1-5。尽管在过去的头颈鳞癌的治疗过程中,手术方式的改变,功能性修复外科的应用,精准放疗、化疗的引入甚至单克隆抗体的治疗等方面的研究获得了一些进步,但是头颈鳞癌患者的五年生存率并没有随着这些新技术的运用而得到显著性的提高,据统计头颈鳞癌患者的五年生存率从53%-61.5%不等1,6,7。虽然在头颈鳞癌治疗中,可能有许多因素可以导致治疗的失败,但在这些治疗失败的患者中,研究人员发现患者存在免疫缺陷8。这些缺陷包括广泛的T细胞失能和肿瘤组织内浸润着大量髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages、TAMs)等免疫抑制性细胞,这些研究为头颈鳞状细胞癌的免疫治疗手段打下了基础。结合当今飞速发展的医学基础学科研究,深刻认知免疫逃逸在头颈鳞癌肿瘤免疫治疗中的机制,将有助与我们提高对头颈鳞状细胞癌的认识,同时对于改善头颈鳞癌的预后具有重要的意义。B7同源体3(B7 Homolog 3,B7-H3)是2001年从人树突状细胞(DC)的cDNA库中克隆得到的B7/CD28超家族的一个新成员9,是一种具有免疫球蛋白样结构的跨膜蛋白,并且具有活化及抑制T细胞功能的双重免疫调节特性9。肿瘤免疫治疗作为《Science》评选的2013年十大科技突破之一10-12 目前在头颈鳞癌的研究仍然方兴未艾。研究表明头颈鳞癌肿瘤微环境中浸润的MDSCs及TAM对于头颈鳞癌的免疫抑制状态的形成及维持具有重要作用13,14。然而在头颈鳞癌中关于B7-H3的表达以及其作为免疫治疗靶点的效果尚不明确。本研究旨在通过免疫组织化学及免疫荧光的方法检测B7-H3在头颈鳞癌中的表达并进一步分析其与患者生存预后之间的关系,此外还通过构建在Tgfbr1/Pten 2cKO的免疫健全的头颈鳞癌转基因小鼠模型来检测B7-H3单抗对肿瘤的抑制作用及机制。研究结果表明:B7-H3在人类头颈鳞癌中高表达,并与不良预后有显著相关性;在Tgfbr1/Pten 2cKO免疫健全的头颈鳞癌转基因小鼠模型中采用B7-H3单抗特异性阻断B7-H3后可减少小鼠体内MDSCs及TAM细胞数量同时增强应T细胞的功能从而提高小鼠机体抗肿瘤免疫效应。第一部分B7-H3在头颈鳞癌组织中的表达水平研究及临床意义分析目的:本部分内容研究目的在于利用头颈鳞癌组织芯片数据的深入挖掘结合患者随访数据的分析,探寻负性免疫调节分子B7-H3在头颈鳞癌中表达情况,继而通过检测B7-H3在头颈鳞癌中的表达与肿瘤性质以及患者生存预后的关系,揭示B7-H3对头颈鳞癌的潜在作用。方法:首先通过使用公共数据库Oncomine深入挖掘编码B7-H3分子的CD276基因在已有癌症研究当中的表达情况;下一步则利用免疫组化的方式检测本课题组建立的头颈鳞癌组织芯片当中B7-H3的表达情况;通过Aperio Scanscope数字化病理技术对其表达情况进行定量分析,同时利用皮尔森相关性分析(Pearson correlation)和簇状聚类分析(Hierarchal clustering)对其在不同组织中的表达进行相关性分析;揭示B7-H3的表达与头颈鳞癌的临床资料、肿瘤病理特征以及患者生存预后之间的统计学关联。结果:负性免疫调节分子B7-H3在头颈鳞癌组织中的表达显著高于正常粘膜(P<0.001),Kaplan-Meier生存分析提示B7-H3高表达组较低表达组总体生存率下降,多因素COX比例风险模型分析提示B7-H3高表达与患者的不良预后有关,可作为头颈鳞癌的独立预后指标;然而头颈鳞癌中不同的组织学分级(P=0.8869)、不同的肿瘤大小(P=0.7321)和不同淋巴结转移组中((P=0.7729)),B7-H3的阳性表达率差异没有统计学意义。结论:B7-H3在头颈鳞癌中高表达且与患者预后负相关。第二部分 在头颈鳞癌中靶向B7-H3在增强抗肿瘤免疫反应中的作用研究目的:MDSCs及TAM在肿瘤免疫逃逸中起重要作用,而B7-H3作为一种负性免疫调节分子对于引起肿瘤免疫逃逸的这群细胞同样发挥着重要作用。利用Tgfbr1/Pten 2cKO的免疫健全的头颈鳞癌转基因小鼠模型,探索B7-H3分子在MDSCs、TAM上的表达情况,以及B7-H3分子在肿瘤免疫逃逸中的作用。方法:采用免疫组化的方法检测B7-H3分子以及髓源性抑制细胞信号(CD11b、Gr1,MDSCs;CD68、CD163,TAM)在头颈鳞癌组织芯片的表达情况,通过Aperio Scanscope对其表达情况进行定量分析,利用Pearson correlation分析和Hierarchal clustering对其在不同组织中的表达进行聚类分析;采用免疫荧光双染检测B7-H3在小鼠模型中髓源性抑制细胞上的表达;使用B7-H3单克隆抗体作用于转基因小鼠体内,采用免疫流式技术检测Tgfbr1/Pten 2cKO小鼠模型体内脾脏、引流淋巴结、肿瘤、血液等组织中免疫抑制性细胞MDSCs、TAM的变化以及效应性细胞CD4+T细胞、CD8+ T细胞的改变,检测阻断B7-H3分子对于头颈鳞癌抗肿瘤免疫的作用。结果:头颈鳞癌中B7-H3分子与髓源性抑制细胞信号的表达高度相关,免疫荧光双染结果显示Tgfbr1/Pten 2cKO小鼠模型中B7-H3分子表达在髓源性抑制细胞上,阻断B7-H3分子可以有效降低Tgfbr1/Pten 2cKO小鼠模型中免疫抑制性细胞MDSCs、TAM的数量,增强CD4+T细胞、CD8+T细胞的功能。结论:阻断B7-H3分子可以减少MDSCs及TAM的数量,同时增强CD4+T细胞、CD8+T细胞的功能。