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目的：人类内源性逆转录病毒(Human Endogenous Retrovirus,HERV)作为一种潜在的“原癌基因”元件参与到肿瘤的发生过程中。在本研究中,运用分子生物学和分子模拟的方法,探讨c-Myb通过与突变的HERV-W3’端长末端重复序列(long-terminal repeat, LTR)结合调控HERV-W env (syncytin-1)基因的表达,进而参与到膀胱癌的发生过程中。从肿瘤病毒学的角度研究HERV-W家族与膀胱癌的发生机制。方法：1、获取82例人膀胱癌及癌旁组织样本,培养人膀胱癌细胞系(T24和5637)及永生化的人膀胱上皮细胞系SV-HUC-1。利用半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR、western blot和免疫组化四种技术检测syncytin-1在膀胱癌组织中的表达情况。2、利用流式细胞实验、MTT实验检测syncytin-1基因的对细胞的增殖能力,利用软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验分析syncytin-1基因的致瘤潜能。3、利用PCR扩增及序列比对技术分析HERV-W3’LTR和5’LTR在膀胱癌组织及癌旁组织中之间的差异。4、利用分子克隆技术和定点突变技术构建了一系列报告基因载体及原核、真核表达载体。在三种膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1、T24、5637)中,利用荧光素酶系统检测3’LTR突变对syncytin-1启动子活性的影响。5、利用转录因子预测系统分析3’LTR突变前后所结合的转录因子的变化,并利用凝胶阻滞实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)、染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)与计算机模拟方法进一步证实候选转录因子(c-Myb, HOXA5)与突变前后的3’LTR的相互作用。同时利用计算机模拟分析出候选转录因子(c-Myb、HOXA5)与突变前后的3’LTR的相互作用过程中关键的氨基酸。并进一步利用EMSA证实其几个关键氨基酸和突变位点的重要性。6、利用共转染及荧光素酶实验检测当3’LTR发生突变时c-Myb和HOXA5对syncytin-1基因启动子活性的影响。7、通过升高或降低c-Myb和HOXA5的表达,并利用半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR和western blot检测c-Myb和HOXA5的表达变化对syncytin-1基因表达水平的影响。结果：1、在82例样本中,75.6%的膀胱癌组织存在syncytin-1的高表达,而仅在6.1%的癌旁组织中存在syncytin-1高表达(P<0.05)。Syncytin-1基因表达的表达水平随着膀胱癌的分级和分期的升高而明显上调。2、流式细胞实验结果显示syncytin-1基因拥有促进SV-HUC-1膀胱上皮细胞增殖的能力。软琼脂集落实验和裸鼠致瘤实验结果显示syncytin-1基因拥有促进肿瘤形成的能力。3、相对于癌旁组织,所有的膀胱癌组织中HERV-W5’LTR不存在突变,而87.8%(72/82)的膀胱癌组织中存在HERV-W3’LTR的突变(P<0.05),并且3’LTR的突变率随着肿瘤的分级和分期升高。3’LTR的突变与syncytin-1的高表达显著性相关(P<0.05)4、在三种膀胱上皮细胞系(SV-HUC-1、T24、5637)中3‘LTR的突变能够上调syncytin-1基因表达和syncytin-1启动子活性。5、转录因子分析软件预测发现3’LTR第一个突变位点(142T>C)发生突变后,LTR所结合的转录因子发生了从HOXA5到c-Myb的转变。EMSA、ChIP及分子模拟实验也证实HOXA5能结合到突变前的3‘LTR,而c-Myb可以结合到突变后的3’LTR。并且荧光素酶实验证实这两种转录因子的高表达都可以在3’LTR突变时增强syncytin-1启动子活性。6、计算机模拟实验预测到c-Myb与3’LTR相互作用的两个关键氨基酸为c-Myb Glu132、c-Myb Lys182,而HOXA5与3’LTR相互作用的关键氨基酸是HOXA5Argl97。通过定点突变及EMSA实验证实以上三个氨基酸在c-Myb或HOXA5与3’LTR的结合过程中的重要性。EMSA实验还证实3’LTR的第一个突变位点(142T>C)是影响转录因子结合的关键碱基位点。7、在三种膀胱上皮细胞系中过表达c-Myb将引起syncytin-1基因的表达量显著上调(P<0.05),但过表达HOXA5基因没有显著影响syncytin-1基因的表达。RNA干扰实验证实,沉默c-Myb基因后可明显降低syncytin-1基因的表达(P<0.05),而沉默HOXA5基因后对syncytin-1基因的表达无显著性改变。C-Myb是通过结合突变的3’LTR改变syncytin-1启动子活性进而上调syncytin-1基因表达。结论：1、本研究揭示了HERV-W3’LTR的突变及syncytin-1基因的高表达与膀胱癌的发生显著相关。HERV-W3’LTR的突变可上调syncytin-1基因的表达。2、Syncytin-1基因的高表达可以促进细胞的增殖和诱导肿瘤的形成。转录因子c-Myb不能结合未突变的3’LTR,而能结合突变的3’LTR,进而上调膀胱癌中syncytin-1基因的表达。3、综上所述,c-Myb可以通过结合突变的3’LTR上调syncytin-1基因的表达参与膀胱癌的发生与发展。Syncytin-1高表达为膀胱癌的预测提供了潜在的分子靶标。本研究将为HERV-W家族在膀胱癌发生机制上的作用提供新的思路。