目的整理分析“治未病”在《金匮要略》杂病诊疗中的应用;从褪黑素角度探讨“知肝传脾,当先实脾”之生物学机制。方法一《金匮要略》“治未病”应用分析采用文献学的研究方法,首先,基于《黄帝内经》、《难经》,探索“治未病”之内涵;其次,基于《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》“治未病”相关原文,分析《金匮要略》“治未病”的理论基础;最后,梳理“治未病”在《金匮要略》杂病诊疗中的应用,总结《金匮要略》“治未病”的应用规律。二褪黑素视角下的《金匮》“知肝传脾,当先实脾”机制研究⒈采用药理学实验研究方法,首先,以“知肝传脾,当先实脾”为例,基于肝郁大鼠模型,从肝功能生化、组织病理学观察、5h D-木糖排泄率等方面,观察肝病模型上述指标的变化,寻求“见肝之病,知肝传脾”的客观证据。通过不同类型方剂(疏肝方、健脾方、疏肝健脾方)先后给药的方式,体现“当先实脾”的治疗方法,观察不同干预方式上述指标的变化,寻求“知肝传脾,当先实脾”的客观证据。其次,检测血清褪黑素含量,探讨“知肝传脾,当先实脾”与血清褪黑素含量变化的关系。⒉基于《素问》“肝传之脾,病名曰脾风”的论述,选择与脾风临床表现相似的淤胆型肝炎大鼠模型作为“知肝传脾,当先实脾”的研究对象,以褪黑素为研究视角,应用GC-MS非靶向代谢组学分析方法,WES、RT-PCR检测技术,从代谢组学分析和抗氧化应激机制两方面探索褪黑素对淤胆型肝炎的干预机制,进而诠释“知肝传脾,当先实脾”的生物学机制。结果一《金匮要略》“治未病”应用分析⒈对《黄帝内经》、《难经》关于“治未病”之原文进行分析,得出:“治未病”源自《黄帝内经》、《难经》,具有三个方面的含义:⑴养生保全,未病先防;⑵防微杜渐,先病而治;⑶即病知传,先变而治。⒉对《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》中“治未病”的内涵进行解读,得出本篇论“治未病”的三个特点:(1)以“若人能养慎,不令邪风干忤经络”为例,强调“养慎”在未病先防中的重要性;(2)以导引、吐纳、针灸、膏摩为例,论述先病而治的具体方法;(3)分别以肝实证和肝虚证为例,从实证和虚证两方面阐释本脏有病,兼顾他脏的已病防传原则。⒊对“治未病”在《金匮要略》杂病诊疗过程中的应用进行总结,得出“治未病”在仲景诊疗杂病中的应用规律:(1)养生保全,未病先防,依据病者体质之别,所感疾病之异,分别采取避风、慎火、和胃及服药调养等不同的调摄方法,内养外慎,以求无病,如麻黄杏仁薏苡甘草汤方后“有微汗,避风”等;(2)防微杜渐,先病而治,不论疾病缓急之别,均宜及早治疗,以求除病于“始萌”,如仲景论肺痈“始萌可救,脓成则死”等;(3)即病知传,先变而治,依据病者津液之虚、中气之弱,常于治疗他病之时顾护津液并兼补中脏;依据病邪之实,所传之虚,通过准确判断疾病之将传,并予先行调补,以求治病于未传,厚朴麻黄汤、薯蓣丸、甘麦大枣汤等皆属此类。二褪黑素视角下的《金匮》“知肝传脾,当先实脾”机制研究⒈基于肝郁大鼠模型的“知肝传脾,当先实脾”与血清褪黑素含量变化的相关性研究基于肝郁大鼠模型,通过不同类型方剂(疏肝方、健脾方、疏肝健脾方)先后给药的方式,探讨“知肝传脾,当先实脾”存在的客观性。首先,肝郁大鼠在肝郁气滞、肝失疏泄等一系列肝郁证候表现的基础上,尚存在大便稀溏、倦怠嗜卧的脾虚证候;肝郁大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL显著升高,尿液5h D-木糖排泄率显著降低,“知肝传脾”客观存在。其次,“当先实脾”可显著减轻肝郁大鼠行为和情绪的异常状态,显著降低肝郁大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL含量,显著改善肝郁大鼠的肝组织损伤,并显著提高肝郁大鼠尿液5h D-木糖排泄率,其疗效优于单纯疏肝、单纯健脾及疏肝健脾之法,“知肝传脾,当先实脾”客观存在。再次,“知肝传脾”—血清褪黑素含量显著降低,“当先实脾”—血清褪黑素含量显著升高,褪黑素含量的变化与“知肝传脾,当先实脾”具有显著相关性。因此,本研究选择褪黑素作为研究视角,开展“知肝传脾,当先实脾”机制研究。⒉褪黑素视角下的“知肝传脾,当先实脾”机制研究⑴“知肝传脾,当先实脾”与褪黑素对氨基酸代谢、谷胱甘肽合成的调控作用相关以褪黑素为切入点,选择淤胆型肝炎模型,基于GC-MS非靶向代谢组学分析技术,探讨褪黑素对淤胆型肝炎的干预作用及其中存在的差异代谢途径,解读褪黑素视角下“知肝传脾,当先实脾”的生物学机制。结果表明:(1)高剂量褪黑素可显著降低淤胆型肝炎大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP、GGT含量,显著改善淤胆型肝炎大鼠组织病理学改变,对淤胆型肝炎大鼠模型具有较好的治疗作用;(2)KEGG通路富集结果表明,8条代谢途径在三组样本对比中具有显著差异:1.ABC transporters(ABC转运蛋白合成途径);2.Glycine,serine and threonine metabolism(甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢途径);3.Metabolic pathways(生物化学代谢总途径);4.Arginine and proline metabolism(精氨酸/脯氨酸代谢途径);5.Phenylalanine metabolism(苯丙氨酸代谢途径);6.Aminoacyl-tRNA biosynthesis(氨酰-tRNA合成途径);7.Tryptophan metabolism(色氨酸代谢途径);8.Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸/蛋氨酸代谢途径)。KEGG代谢通路富集结果表明褪黑素对淤胆型肝炎的干预作用涉及氨基酸、能量、碳水化合物及脂类的代谢途径,外来化合物的降解途径,氨酰-tRNA的合成过程,以及甘氨酸三甲胺内盐/脯氨酸、谷胱甘肽、α-葡糖糖苷的转运过程;(3)差异代谢物筛选结果表明,62个差异代谢物在三组样本对比中具有显著差异,结合KEGG通路富集结果分析,7个与氨基酸代谢相关的差异代谢物存在于上述8条代谢途径中:5-氨基戊酸,5-甲氧色胺,L-色氨酸,苏氨酸,谷胱甘肽,L-蛋氨酸及吲哚乳酸,以上7个差异代谢物被识别为褪黑素干预淤胆型肝炎的潜在生物标记物,对临床淤胆型肝炎的诊断、评价褪黑素对淤胆型肝炎的治疗作用具有重要的意义。KEGG通路富集结果及差异代谢物筛选结果表明褪黑素对肝病的治疗作用与氨基酸代谢及谷胱甘肽合成密切相关,为“知肝传脾,当先实脾”中褪黑素对肝病的干预机制提供了实验室依据。⑵褪黑素的抗氧化应激作用为“知肝传脾,当先实脾”的生物学机制之一以谷胱甘肽为切入点,采用WES、RT-PCR检测技术,探讨“知肝传脾,当先实脾”的抗氧化应激机制。结果表明:(1)褪黑素可显著提高淤胆型肝炎大鼠肝组织GSH含量,降低NO、MDA含量,抗氧化作用为褪黑素干预淤胆型肝炎的重要作用之一;(2)褪黑素可有效提高淤胆型肝炎大鼠肝组织中GCLM蛋白、GCLC mRNA及Akt mRNA的表达量,对GSH合成具有一定的干预作用,PI3K/Akt信号通路的扰动可能为褪黑素干预淤胆型肝炎的抗氧化应激机制之一;(3)褪黑素对淤胆型肝炎大鼠肝组织中NADPH蛋白/mRNA表达无显著干预作用,未对GSH还原动态造成扰动,褪黑素对Nrf2蛋白/mRNA表达的干预作用不显著。结论⑴《金匮要略》“治未病”应用分析“治未病”贯穿于《金匮要略》对杂病的诊疗过程,仲景在“治未病”的指导下,不仅在方药上进行精妙的配伍,还在调护手段、煎服方法以及剂型选择、饮食作息方式等方面进行全面的配合,顺应疾病的发展趋势,把握疾病的最佳治疗时机,因势利导,无伤其和,最终达到未病先防、先病而治、先变而治的目的。⑵褪黑素视角下的《金匮》“知肝传脾,当先实脾”机制研究(1)“知肝传脾,当先实脾”客观存在,且与血清褪黑素含量变化具有显著相关性,褪黑素为探讨“知肝传脾,当先实脾”生物学机制的研究视角之一。(2)褪黑素显著改善了淤胆型肝炎大鼠生物氨基酸、能量、碳水化合物、外来化合物及脂类代谢途径的异常状态,并影响了甘氨酸三甲胺内盐/脯氨酸、谷胱甘肽、α-葡糖糖苷的转运动态及氨酰-tRNA的合成过程,其中尤以对氨基酸代谢途径的扰动最为显著。(3)褪黑素可提高谷胱甘肽合成酶表达,促进谷胱甘肽合成,激活PI3K/Akt信号通路,进而显著改善了淤胆型肝炎的氧化应激干扰状态。(4)“当先实脾”通过调控血清褪黑素含量,改善生物氨基酸代谢,促进谷胱甘肽合成,并激活PI3K/Akt信号通路,进而对肝病产生较好的治疗作用,以上生物过程部分诠释了褪黑素视角下“知肝传脾,当先实脾”的科学内涵。