自交不亲和性广泛存在于显花植物中,是植物长期进化出的一种为防止近交从而保持多样性的生殖隔离机制。苹果等蔷薇科植物属于S-RNase介导的配子体自交不亲和类型。目前研究认为,花柱分泌的S-RNase通过MdABCF蛋白帮助非特异进入花粉管中,非自我S-RNase被花粉SFB/SLF识别并标记泛素,进而被26S蛋白酶体降解；自我S-RNase作为“细胞毒素”抑制花粉管生长,而至今S-RNase发挥“细胞毒性”的机制尚存在争议,其具体分子机制尚未得到阐明。本研究以苹果‘国光’为试材,构建了花粉cDNA文库,以S2-RNase的成熟多肽区为诱饵利用酵母双杂交筛库的方法筛选得到一个与之互作的可溶性无机焦磷酸酶蛋白,并对该蛋白参与苹果自交不亲和的作用机制进行了研究,具体结果如下：1.以S2-RNase成熟区域为诱饵筛选苹果‘国光’(S1S2)花粉酵母cDNA文库,获得了2个序列完全相同、长度为484 bp的片段(A14和A24,以下由A14代表),克隆全长后发现该基因CDS全长为654 bp,编码217个氨基酸。酵母双杂交、pull-down及玉米原生质体双分子荧光互补实验证明A14与Si-, S2-, S3-, S9-RNase均存在物理互作关系。2.将A14氨基酸全长序列置于NCBI比对,发现该基因编码蛋白属于家族Ⅰ类可溶性无机焦磷酸酶。利用A14重组蛋白酶活性鉴定发现A14蛋白可在镁离子存在下可水解PPi,钙离子和EDTA可竞争性抑制其活性,因此命名该基因为MdPPa。qRT-PCR分析发现MdPPa在花粉和花粉管中表达量最高。基因枪瞬时转化苹果花粉管结果显示该基因定位于花粉管胞质中,与玉米的原生质体转化结果一致。以上结果表明,MdPPa主要在花粉管胞质中行使水解PPi的功能。3.花粉免疫荧光实验发现S-RNase和MdPPa在花粉管胞质中存在共定位。离体蛋白免疫沉淀实验证明自我S-RNase能够在花粉管胞质中结合MdPPao分别使用15 μg /mL的自我(SPI)或异我(CPI) S-RNase处理花粉后检测发现, SPI处理下花粉管内源无机焦磷酸酶活性显著低于CPI处理,而PPi的含量却显著高于CPI处理。将重组的S1-, S2-, S3-, S9-RNase分别与MdPPa蛋白孵育检测发现,随S-RNase浓度升高MdPPa活性不断降低,表明S-RNase可以直接抑制MdPPa活性。此外,自花授粉花柱花粉管内源无机焦磷酸酶活性显著低于异花授粉处理,而PPi含量却显著高于异花授粉处理。将MdPPa分段后分别与S-RNase进行互作分析,结果显示MdPPa的两个可变区与S-RNase存在相互作用。制作该酶促反应米氏方程,分析双倒数曲线后显示,S-RNase作为非竞争抑制剂抑制MdPPa水解PPi的活性。以上结果表明,苹果自我的S-RNase可进入花粉管中结合并抑制MdPPa,造成花粉管内源无机焦磷酸酶活降低,PPi含量升高。4.利用反义寡核苷酸as-ODN转染下调MdPPa表达后发现,as-ODN处理的花粉管生长受到明显的抑制,花粉管内源无机焦磷酸酶活性显著降低,PPi含量显著增加,说明MdPPa对花粉管生长必不可少。针对花粉管中含有的tRNAAla和tRNAGly设计合成了地高辛标记的互补探针,检测了不同处理下花粉管内tRNAAla和tRNAGly氨酰化的情况,结果显示,SPI和as-ODN处理下花粉内均能明显检测到未氨酰化的tRNAAla和tRNAGly,证明SPI处理和as-ODN沉默MdPPa所引起的PPi积累都能造成花粉管内tRNA氨酰化过程受阻,导致蛋白不能正常合成,最终抑制花粉管生长。授粉实验和后代S基因型分析发现,苹果‘CAU-1’自交亲和性由花粉侧的非S因子突变造成,qRT-PCR检测发现MdPPa在‘CAU-1’和‘富士’中表达量无显著差异,推测其自交亲和性可能由其他花粉非S因子变异造成。