研究目的:青光眼是一类以进行性视网膜神经节细胞凋亡以及视野缺损为特征的不可逆性视神经退行性病变，其发病机制目前尚不完全清楚，高眼压是POAG发生的主要危险因素。位于前房角的小梁网和Schlemm管是房水引流系统的主要组成部分，小梁网和Schlemm管异常可以影响房水流出进而影响眼内压力，因此这两部分结构在POAG的发病过程中起了重要的作用。 POAG发病因素有青光眼致病基因、血管异常、高眼压诱导的毒性作用及机械性损伤以及局部组织的氧化损伤。许多研究已显示POAG患者小梁网细胞(GTM)进行性丢失以及形态学的改变与老年人小梁网细胞的改变相一致，提出了衰老的POAG患者小梁网细胞假说。众所周之，氧自由基(ROS)以及线粒体在生物体内细胞衰老的过程中扮演了重要角色，在青光眼研究方面已有证明表示氧自由基可以影响人小梁网细胞的组成结构，提出ROS与小梁网细胞的退行性改变相关；还有学者发现青光眼患者房水中抗氧化剂活性的下降，并且眼压的升高与视野缺损的程度与小梁网细胞DNA的氧化损伤成正比。这些研究均提示氧化损伤可能参与了POAG患者小梁网细胞的病理改变。但迄今为止，对POAG患者小梁网细胞减少以及退行性改变的分子机制还有许多有待揭示之处。本研究目的在于认识POAG小梁网细胞的线粒体功能，从分子水平上了解线粒体在POAG患者小梁网细胞退行性改变过程中的作用机制。 研究方法: 本研究以原代POAG患者小梁网细胞(GTM)为研究对象，原代正常人小梁网细胞(NTM)为对照，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞技术观察细胞内ROS水平，随后分别经过线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抑制剂鱼藤酮(Rotenone，ROT)、TTFA、AM、MYX，抗氧化剂VitE、NAC处理后检测细胞内ROS的改变以及不同浓度ROT对小梁网细胞ROS产生的影响；采用流式细胞技术、MTT检测ROT对小梁网细胞的生长抑制作用及其对细胞生长周期的影响；应用生物化学发光技术检测细胞内ATP产量；紫外分光光度计检测线粒体呼吸链复合物活性；活细胞及激光共聚焦显微镜下观察各加药组细胞的形态；通过AnnexinV—FITC/PI双标记及流式细胞技术检测细胞的凋亡率；LDH试剂盒检测细胞损伤；用JC-1标记细胞线粒体膜电位(△Ψm)，并分别通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测ROT以及线粒体通透性转换孔(MPTP)抑制剂CsA—ArA对小梁网细胞△Ψm影响的差异。使用流式细胞技术检测了CytC的释放，进一步证实了ROT诱导GTM细胞凋亡的线粒体通路。为进一步观察GTM细胞MPTP开放的机制，采用ROT诱导，激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪观察ROT对细胞内钙离子分布的影响，观察钙离子在GTM细胞MPTP开放中的作用，分析研究了通过ROT诱导GTM细胞MPTP开放、CytC释放和钙离子诱导的线粒体钙释放(mCICR)之间的关系；为了进一步研究ROT诱导GTM内升高的钙离子是来源于细胞外还是细胞内，应用流式细胞仪观察IP3R抑制剂2-APB和Xe—C、L—型钙通道抑制剂nifedipine处理后细胞内钙信号的变化。 实验结果: 一、POAG患者小梁网细胞线粒体ComlexⅠ活性下降引起ROS产生增多 1.小梁网细胞鉴定：原代正常人和POAG患者小梁网细胞均表达FN、LN、NSE、vimentin；第Ⅷ因子阴性。 2.原代POAG患者小梁网细胞内ROS水平明显高于正常人，差异有统计学意义(P<0.05)。 3.线粒体ComlexⅠ抑制剂ROT对GTM细胞ROS的诱导作用呈时间—浓度依赖性。抗氧化剂VitE和NAC均可以抑制ROT诱导GTM细胞内ROS的产生。 4.MTT检测线粒体ComlexⅠ抑制剂ROT呈浓度—时间依赖性抑制GTM生长。 5.流式细胞技术显示ROT影响GTM细胞周期，使细胞停滞于S期，并抑制细胞DNA的合成。 6.GTM线粒体ComlexⅠ活性下降以及细胞内ATP产量减少。 7.ROT诱导GTM细胞凋亡和死亡，随浓度增大而增多。抗氧化剂VitE、NAC以及MPTP抑制剂CsA—ArA可以抑制ROT所诱导的GTM细胞凋亡和死亡。 二、POAG患者小梁网细胞△Ψm、MPTP、CytC和[Ca2+]c 1.GTM△Ψm下降，GTM线粒体膜电位去极化与MPTP密切相关，是CsA敏感依赖性的。 2.线粒体ComlexⅠ抑制剂ROT诱导GTMCytC的释放，诱导CsA依赖性MPTP开放。 3.ComlexⅠ抑制剂ROT促进GTM细胞[Ca2+]c的进一步升高，并呈时间—浓度依赖性，BAPTA/AM可以抑制ROT诱导的线粒体△Ψm去极化。 三、POAG线粒体ComlexⅠ活性下降促进Ca2+和mCICR介导的MPTP的开放 1.ROT促进Ca2+介导的MPTP的开放：ROT使GTM细胞线粒体膜电位去极化。不同浓度Ca2+加ROT可以使GTM细胞△Ψm进一步降低。BAPTA/AM可以抑制ROT诱导的GTM线粒体膜电位去极化。 2.ROT促进mCICR介导的MPTP的开放：ROT或Ca2+诱导GTM线粒体Ca2+的升降，发生mCICR；RR可以抑制或减弱ROT诱导的线粒体Ca2+的升降变化，相应地线粒体△Ψm变化被完全或部分抑制。 3.ROT诱导的GTM细胞[Ca2+]c的升高与细胞内钙库(内质网和/或线粒体)的动员与再分布有关：IP3R抑制剂2-APB可以显著抑制ROT诱导GTM细胞内[Ca2+]c的升高；而L—型钙通道抑制剂nifedipine未见明显影响。 结论: 1.GTM内ROS水平明显高于正常人。 2.GTM线粒体ComlexⅠ活性下降，其下降程度与ROS产生的水平成正比。 3.GTM细胞△Ψm下降，线粒体ComplexⅠ活性下降可能通过降低△Ψm而引起细胞功能障碍。小梁网细胞线粒体△Ψm去极化与MPTP密切相关，是CsA敏感依赖性的。即下降的线粒体ComplexⅠ活性与CsA依赖性MPTP开放有关。 4.ROT诱导的线粒体ComlexⅠ活性下降，通过降低△Ψm，促进CsA依赖性MPTP开放和CytC释放而诱导细胞凋亡和死亡。抗氧化剂VitE、NAC以及MPTP抑制剂CsA—ArA可以抑制ROT所诱导的GTM细胞凋亡和死亡。 5.ROT可以引起GTM胞质内Ca2+的持续升高。而[Ca2+]c的升高主要是由于线粒体ComlexⅠ活性下降引起细胞内钙库(内质网和/或线粒体)的动员与再分布有关。 6.Ca2+和mCICR是GTM线粒体ComlexⅠ活性下降诱导线粒体△Ψm降低、MPTP开放所必需的。线粒体ComlexⅠ活性水平与MPTP开放程度成正比。