MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控基因表达功能的非编码小RNAs,可以在转录后水平调控基因的表达,通过与靶mRNA3’非编码区(3’UTR)特异性地结合,导致靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译。由于miRNAs在基因水平广泛的调控作用使得它们成为引人注目的生物标志物和各种疾病治疗的潜在靶点。对细胞内miRNAs的表达或功能具有调控活性的化学小分子可以作为分子探针用于研究细胞内miRNA的调控网络,而且基于其对重要疾病相关的miRNA的调控可能在将来的疾病治疗方面有着潜在的重要作用,论文主要围绕筛选对多种miRNA具有调控活性的化学小分子及其相关的调控机制展开了化学生物学的研究工作,主要研究内容分以下四个部分：1.基于活细胞的miRNA小分子调控剂筛选体系的构建。在本部分研究中,我们分别应用了两种报告基因系统,即荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因,使得细胞内特定miRNA受化合物调控的情况可通过细胞产生的生物发光信号或荧光信号的变化读出。在基于荧光素酶报告基因的筛选体系中,将需检测的miRNA的互补序列插入荧光素酶基因的3’UTR端,构建好的质粒转染进入细胞中。正常情况下,细胞内源性的miRNA可以和它的靶序列结合,导致Luciferase的表达受到抑制,在化学小分子刺激细胞后,细胞内源性的miRNA表达或功能可能受到调节,而小分子对细胞内特定miRNA是否具有调控作用以及调控活性的相对强弱通过报告基因表达产生的生物发光信号的相对变化给出初步的判断。用绿色荧光蛋白作为报告基因的筛选系统构建基于同样的原理,但需通过细胞流式仪来检测细胞在经化学小分子刺激后荧光的变化,因而其在筛选活性小分子时不能实现高通量,有一定的局限性。2.对小分子化合物库中小分子的毒性及调控miRNA活性的评估。基于论文第一部分工作中构建的荧光素酶报告基因的活性分子筛选体系,我们首先对本实验室经过光反应等合成方法得到的小分子库中的化学小分子进行了细胞毒性及调控细胞内miRNA活性的初步评估。针对在10μM浓度下没有明显细胞毒性的小分子,我们分别测试了它们在Hela细胞中对与癌症发生密切相关的miR-21、在C2C12细胞中对肌肉特异性miR-1及miR-133、在HepG2细胞中对肝脏特异性miR-122等miRNA的调控活性,为我们寻找不同类型的miRNA小分子调控剂所具有的结构特征提供了基础的信息。3.对miRNA具有广谱激活作用的活性小分子的获取及其调控机制研究。从1,4-萘醌和二苯乙炔的光反应产物中我们初筛得到了一个活性小分子2a-4,其对miR-21、miR-1及miR-122等多种类型的miRNA都显示出了激活作用,是miRNA的广谱激活剂。对于miRNA广谱激活细胞内miRNA的机制我们也进行了探索,结果显示该小分子作用后的细胞中各种前体miRNA (pre-miRNA)的水平降低,而成熟体miRNA的表达水平被显著提升,显示化合物在细胞中可促进pre-miRNA至成熟体miRNA的加工成熟过程。进一步对细胞内与miRNA加工成熟密切相关的功能蛋白包括AGO2, TRBP等的表达水平在化合物作用前后的比较显示化合物可能通过上调TRBP的表达实现对miRNA的广谱激活。4.广谱激活剂型小分子探针构建方法的探索。基于论文第三部分所发现的广谱抑制剂小分子2a-4,我们通过1,4-萘醌与其它芳基取代炔烃的光化环加成反应合成了一系列2a-4的类似物,希望从中获取相关的结构-活性关系的重要信息以构建带有生物正交官能团的小分子探针。并对这类化合物的活性进行了深入研究。遗憾的是,经过大部分取代基团修饰的2a-4的类似物在10μM浓度下都表现出较强的细胞毒性,而将化合物在无明显毒性的浓度下处理细胞后,其对细胞内miRNA的激活活性也随之大幅下降,因此在这些结构部位修饰生物正交官能团的可行性不大。