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奶山羊是我国重要的经济动物,保持和优良奶山羊品种,实现快速繁殖是现代农业的目标,奶山羊雄性生殖干细胞(male germline stem cell,mGSCs)自我更新的维持和发育分化的相关基础性研究也逐步深入,家畜mGSCs体外培养体系不稳定、重编程效率低等问题都亟待解决。研究表明表观修饰在精子发生过程中发挥着重要的调控作用。特定位点的DNA甲基化动态变化是维持正常精子发生的关键。Tet1(Ten-eleven translocation 1)作为主要的去甲基化酶,参与精子发生的表观修饰调控进程。因此,开展mGSCs的表观遗传学研究,不仅有助于探究成体干细胞体外培养技术的优化体系,推进mGSCs自我更新与分化机理的探索;而且在畜牧业生产上对提高优良种畜的精子质量,减少疾病发生,促进家畜大动物优良品种的遗传与繁育有重要意义。本研究以奶山羊为研究对象,对Tet1及产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)进行表达谱和定位分析,同时探究了奶山羊精子发生过程中的dimethyl histone H3 lysine 9(H3K9me2)和tri-methyl H3 lysine 9(H3K9me3)在不同年龄阶段睾丸组织的甲基化模式;利用Tet1过表达的方法修饰mGSCs并筛选阳性单细胞克隆,观察细胞形态学、基因表达差异和DNA甲基化、组蛋白甲基化的变化;通过自发分化与体内移植对Tet1过表达的mGSCs进行功能验证,并分析Tet1与蛋白互作的调控机理。结果发现:(1)Tet1在奶山羊睾丸组织中表达水平较低,且主要分布于曲细精管基底膜的精原细胞中;对其产物5hmC在不同年龄阶段奶山羊睾丸组织中的含量与定位进行检测,表明5hmC随年龄增加而降低,且在mGSCs与支持细胞都有分布;奶山羊精子发生过程中的组蛋白H3K9me2在不同年龄阶段睾丸组织呈现先升后降的模式,在青春期达到峰值;而H3K9me2含量则是随年龄增长持续缓慢升高。成年睾丸组织中dimethyl histone H3 lysine 4(H3K4me2)定位于减数分裂后期的圆形精细胞,tri-methyl H3 lysine 27(H3K27me3)在mGSCs中呈现特殊的核周定位;在体外培养的mGSCs中,Tet1在维持自我更新的mGSCs中表达,在分化状态下表达降低;5hmC与其表现同样的趋势;同时对体外培养的mGSCs中H3K9me2和H3K9me3进行检测,发现维持自我更新的mGSCs克隆和趋于分化的克隆及未形成克隆的细胞相比含量含量较低。(2)生物信息学分析不同物种间Tet1基因的遗传同源性和保守结构域,通过对Tet1基因共有的发挥功能关键的识别结构域和催化结构域进行分析,确定小鼠Tet1(mTet1)在山羊源细胞中发挥作用;筛选Dox诱导表达mTet1的阳性单细胞克隆,在基因、mRNA和蛋白水平进行鉴定后观察细胞形态,发现mTet1阳性细胞细胞核变大,且5hmC含量增加;通过阶梯浓度培养确定0.50μg/mL的Dox浓度为最佳的诱导培养浓度;QRT-PCR、免疫荧光染色和western blot检测发现mTet1阳性细胞中Gfra1、PCNA、CCND1、Ki67、ETV5等增殖和生殖特异性标志基因表达上调,分化特异性基因REC8表达下调;Tet1过表达的奶山羊mGSCs的阳性细胞,组蛋白甲基化相关的H3K9me2和H3K9me3含量有所下降,且H3K9me3由细胞核内颗粒状分布转变为均匀分布;H3K27me3含量显著降低,由细胞核内均匀分布转变为向核周分布。(3)构建过表达Tet1慢病毒载体,对筛选出的稳定过表达Tet1的奶山羊mGSCs阳性克隆(mGSC-pCDH-mTet1)细胞进行QRT-PCR检测,筛选出既能维持mGSCs自我更新又促进细胞增殖的克隆;制备mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的类胚体(EBs),自发分化试验检测体外分化能力,发现mGSC-pCDH-mTet1细胞自发分化后的细胞三胚层分化的速度较慢,说明mTet1具有维持自我更新、抑制分化的功能;对生殖缺陷小鼠模型进行mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的曲细精管移植,4周采集睾丸,制成石蜡切片,并进行PGP9.5、VASA、PCNA、Ki67等生殖与增殖相关特性标记的检测,证实mGSC-pCDH-mTet1细胞在生殖缺陷小鼠的曲细精管内不仅维持mGSCs的特性,还有显著的增殖能力。(4)对mTet1在mGSCs中发挥作用的方式进行分析,确认mTet1通过上调组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达,下调H3K27me3的含量并发生从核内向核周分布的定位变化,此过程伴有MEK-ERK信号通路的抑制;mTet1通过与Hdac1形成蛋白复合体,共同调节组蛋白乙酰化状态,进行mGSCs的表观修饰调控;mTet1与PCNA形成蛋白复合体,通过mTet1过表达来促进mGSCs的增殖。综上所述,本研究从体内和体外分析了Tet1在奶山羊曲细精管和细胞中的分布;同时研究Tet1修饰引起的形态变化和基因调控机理。这不仅为精子发生过程中Tet1表达调控进一步的研究提供思路,为更深入探究表观修饰调控在奶山羊mGSCs的发育与分化作用奠定了基础。