目的:慢性乙型肝炎作为一种我国常见的慢性传染病,严重地危害着国民的生命健康。机体的免疫功能在机体清除HBV的过程中发挥着重要的作用。目前TCRγδ+T(γδT)细胞与慢性乙型肝炎的关系还研究甚少,因此本研究以慢性HBV感染者为研究对象,以健康者作对照,探讨外周血或肝穿组织的γδT等细胞是否有差异,分析与其它免疫细胞及临床指标是否有相关性;同时观察分离及刺激的γδT细胞在体外的免疫功能。为了解γδT细胞在慢性乙型肝炎免疫发病机理中的作用提供一些实验基础和依据。方法:1.外周血γδT细胞与机体的免疫或临床状态的相关性研究:用流式细胞分析法,检测40例慢性无症状HBV携带者(AsC),30例慢性乙型肝炎(CHB)轻度,50例慢性乙型肝炎(CHB)中度至重度,及24例健康献血员的外周血中γδT/T、δ2T/γδT、CD45RO+γδT/γδT、CD45RO+δ2T/δ2T、CD45RO+T/T、CD4+/T、CD8+/T、NK/lym(淋巴细胞)的细胞比例。以SPSS13.0统计软件分析健康对照及慢性HBV感染者各组间细胞比例的差异是否有显著性;分析慢性HBV感染者各样本的γδT、δ2T、CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T的细胞比例是否与免疫细胞CD45RO+ T、CD4+、CD8+、NK等的比例具相关性,及是否与HBV-DNA或肝功具相关性。2.慢性HBV感染患者肝穿标本γδT细胞的检测与分析:用免疫组织化学方法,检测5例慢性HBV感染患者肝穿标本冰冻切片的γδT细胞。计数10个高倍视野的γδT细胞数,用SPSS13.0软件分析γδT细胞数与外周血的γδT、δ2T细胞数的相关性。3.外周血γδT细胞的分离、刺激与扩增:外周血经密度梯度离心,2h贴壁及流式细胞阴性分选方法,分离6例慢性HBV感染者、3例健康对照者外周血γδT细胞,分析γδT细胞的纯度及活性。以0.2、0.5、1、2μg/mL anti-Vγδ与50 U/ mL rhIL-2分别刺激扩增γδT细胞14天,观察细胞的状态及数量,确定刺激的最佳浓度与时间。4.外周血来源的γδT细胞的免疫功能的体外研究:4.1建立LO2-mock、LO2-HBV细胞模型:EcoRⅠ酶切掉pEcob6质粒内的双拷贝HBV-DNA片段,自身连接作mock对照质粒。以阳离子脂质体转染方法,转染人肝源性非癌细胞LO2,用G418筛选出高效表达HBV相关抗原的抗性细胞克隆。用免疫荧光法、ELISA、AXSYM (Abbott)、FQ-PCR等方法检测LO2、LO2-mock、LO2-HBV细胞内或上清中HBsAg、HBcAg/HBeAg、HBV-DNA的含量;用流式细胞仪检测转染细胞MICA/B的表达。4.2γδT细胞的免疫功能的体外研究:用ELISA法检测经刺激扩增后的γδT细胞上清的TNF-α、IFN-γ的分泌;用LDH释放法检测γδT细胞对LO2、LO2-mock、LO2-HBV的杀伤作用;比较分析6例慢性HBV感染者与3例健康对照者γδT细胞的免疫功能的差异。结果:1.经H检验可知,γδT、CD45RO+γδT细胞比例总体的差异无显著性(P>0.05),而δ2T(P<0.01)、CD45RO+δ2T(P<0.05)比例的差异却有显著性。进一步分割检验,可得健康对照组的δ2T比例与其它组的差异均有显著性(P<0.01);CHB中重度组的δ2T比例与其它组的差异有显著性(P<0.01);健康对照组的CD45RO+δ2T比例与AsC组及CHB中重度组的差异有显著性(P<0.05)。经H检验或F检验可得,健康对照组与AsC组的CD45RO+T(%)的差异有显著性(P<0.05);健康对照组与CHB轻度组的NK(%)的差异有显著性(P<0.05)。2.经Spearman相关分析可得,δ2T与γδT细胞比例正相关(P<0.05),与CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T比例间呈负相关(P<0.01);γδT与CD4T比例负相关(P<0.01);CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T、CD45RO+T比例间高度正相关(P<0.01)。同时δ2T比例与ALT、AST、TB均呈显著的负相关(P<0.01);而CD45RO+γδT、CD45RO+δ2T与DB呈显著的正相关(P<0.05);HBV-DNA不与任一细胞比例相关(P>0.05)。3.从所做的5例肝穿标本看,γδT的计数均较低,平均每个高倍视野仅能见2-3个阳性细胞。经Spearman相关分析,肝穿组织γδT细胞计数与外周血γδT、δ2T细胞数间无相关性(P>0.05)。4.经流式阴性分选后,γδT细胞的纯度从<23%提高到>71%,细胞活性大于90%;20ml外周血约可分到106左右的γδT细胞。在光镜下观察发现0.2μg/mL浓度的anti-γδ刺激γδT细胞9天较好。5.经LSCM可观察到,LO2-HBV细胞内HBsAg表达主要位于细胞浆内而HBcAg可于胞核也可位于胞浆内,且HBsAg的荧光强度明显强于HBcAg;LO2-HBV细胞上清的HBsAg/HBeAg为阳性,HBV- DNA为9.67×104 copies/mL。而LO2及LO2-mock细胞均未检测到HBV相关抗原的表达及HBV-DNA。LO2-HBV、LO2-mock、LO2细胞MICA/B的表达(MFI)分别为13.3±0.7、7.4±0.9、4.2±0.6,经F检验,差异具显著性(P<0.01)。6.经ELISA检测,慢性HBV感染者的γδT细胞分泌IFN-γ及TNF-α分别为140.8±82.9pg/mL、129.8±71.5pg/mL,健康对照者的为440.7±172.8pg/mL、233.4±218.0pg/mL。经t检验得,两组的IFN-γ的分泌的差异有显著性(P<0.01),而TNF-α无显著性差异(P>0.05)。7.经LDH释放法可检测到,在效靶比为30:1下,慢性HBV感染组对靶细胞LO2、LO2-mock或LO2-HBV的杀伤率为9.98±1.2%、11.05±3.5%、18.1±6.0%;而健康对照组的为16.6±1.04%、18.7±0.98%、31.5±4.16%。经t检验得,两组对三种靶细胞的杀伤能力的差异均具显著性(P<0.05);同时LO2与LO2-HBV间,LO2-mock与LO2-HBV间杀伤率的差异有显著性(P<0.05)。结论:1.慢性HBV感染不会引起外周血γδT细胞比例的显著性改变,但可使δ2T亚型比例降低;慢性HBV感染患者外周血的γδT仍以δ2T细胞亚群为主;CD45RO+δ2T细胞亚群是CD45RO+γδT细胞的主要组成成分。2.慢性HBV感染患者γδT与CD4比例呈负相关,与特异性CD8T或非特异性NK细胞不成显著相关,提示γδT可能与辅助型T细胞免疫反应相关;慢性乙型肝炎的肝细胞高免疫炎症状态(ALT/AST升高)伴随着外周血δ2T细胞的减少;但HBV-DNA的载量不影响γδT细胞比例。3.本实验采用流式阴性分选的方法来分离外周血γδT细胞从细胞纯度或活性上分析是基本可行的;获得LO2-mock、LO2-HBV稳定传代细胞株,可用作本实验的靶细胞,也可用于分泌HBV-DNA的转染细胞是否会影响γδT细胞的杀伤功能的实验研究。4.经刺激的慢性HBV感染者的γδT细胞IFN-γ分泌能力及杀伤LO2、LO2-mock与LO2-HBV的能力均弱于健康对照者,而TNF-α无显著性差异。提示慢性HBV感染者的γδT细胞分泌IFN-γ能力较弱是其杀伤功能低的重要因素。5. LO2与LO2-HBV,LO2-mock与LO2-HBV间杀伤率的差异有显著性,结合细胞MICA/B分析,提示HBV-DNA的复制或转录可增强细胞MICA/B的表达,进而提高γδT细胞对之的杀伤效应。