水稻是重要的粮食作物,全世界二分之一的人口以水稻为主食。一方面,水稻雄性不育严重影响水稻产量,另一方面,雄性不育与杂种优势结合可为水稻遗传改良提供方便。水稻雄性不育突变体的研究有助于人们了解雄性不育的分子机制。水稻雄性器官的发育是一个非常复杂且高度有序的生物学过程。因此,阐明水稻雄性不育的分子机制对育种工作者具有重要的实践意义。本课题通过⁶⁰Co-γ诱变中恢8015得到一个遗传稳定的雄性不育突变体,命名为:fignl1。为了探索其雄性不育的原因,通过花药半薄切片、扫描电镜和透射电镜对fignl1突变体和野生型的花药进行了表型分析。此外,对该雄性不育基因进行了图位克隆、转基因验证以及基因功能分析等相关研究,主要研究结果如下:1.通过对水稻雄性不育突变体fignl1的表型鉴定和细胞学分析,发现fignl1突变体植株营养生长正常,植株完全不育。与野生型相比,fignl1花药淡黄,瘦小,花粉100%典败。对其授予野生型中恢8015的花粉,突变体仍能结籽,表明该突变体雌配子发育正常,雄配子败育。扫描电镜观察显示,突变体花粉粒不规则,花粉内部无淀粉粒、精细胞和营养细胞;fignl1花粉内外壁发育异常,基足层和覆盖层更膨大。与野生型相比,突变体花药外壁更致密,内壁结构异常。2.野生型和fignl1突变体不同发育时期花药半薄切片分析表明,在小孢子大液泡时期突变体绒毡层发育异常,降解速度缓慢。在此时期,小孢子形态开始发生异常,在成熟花药中,fignl1突变体花药内壁残存一层绒毡层细胞,并且没有任何填充物,小孢子严重变形,内层膨大。细胞学观察表明:fignl1突变体在减数分裂粗线期出现细丝状染色体,在终变期出现大量的相互缠绕的多价染色体、畸形染色体和染色体桥。在减数分裂中期出现未配对的染色体和染色体桥。在第二次减数分裂过程中fignl1突变体的花粉母细胞出现染色体碎片和落后的染色体,最终导致在四分体时期单倍体细胞核的染色体数目不同。以上结果表明,由于OsFIGNL1功能缺失严重影响了减数分裂过程中染色体的行为,最终导致小孢子发育缺陷。3.遗传分析表明,突变体fignl1的雄性不育表型受一个隐性核基因控制。以突变体为母本,以中花11为父本杂交得F₂分离群体,利用F₂分离群体的中的2300个隐性单株将该雄性不育基因OsFIGNL1精细定位于新开发的分子标记S7和S8之间约250Kb的物理区域内,该区域包含12个开放阅读框。经测序比对发现,与野生型相比,fignl1突变体在Os12g0443800.1的第三个外显子处存在一个单碱基A的缺失,导致所编码蛋白在第187位氨基酸处发生翻译的提前终止。此外,我们发现在日本晴数据库中Os12g0443800.1和Os12g0443800.2这两个转录本均被注释为ATP水解酶。RT-PCR测序结果揭示Os12g0443800.2转录本的cDNA序列与日本晴网站预测的结果不一致。最终我们发现Os12g0443800.1和Os12g0443800.2实际上为一个转录本,即Os12g0443800。Os12g0443800基因由12内含子和13个外显子组成,cDNA全长为2085bp,编码694个氨基酸的蛋白质。Os12g0443800基因编码一个AAA-ATPase蛋白。转基因功能互补试验证实野生型Os12g0443800基因可以恢复fignl1突变体雄性不育的表型。4.qRT-PCR分析OsFIGNL1的表达模式,我们发现OsFIGNL1基因在水稻根、茎、叶、叶鞘以及不同发育时期的花药组织中均有表达,但在减数分裂时期的花药组织中表达量最高,在花药发育后期表达量又逐渐降低。利用水稻原生质体对该基因进行亚细胞定位分析发现,OsFIGNL1定位于水稻原生质体细胞核中。利用大肠杆菌体外表达系统表达出了该蛋白的AAA结构域,发现该结构域具有较高的ATPase活性。系统进化树和蛋白序列比对显示,FIGNL1基因在单子叶、双子叶和动物中广泛存在,说明FIGNL1基因在不同物种中非常保守。5.酵母双杂和Bi FC实验结果表明,OsFIGNL1与水稻RAD51A1、RAD51A2、DMC1A和DMC1B在体内发生互作。亚细胞定位结果表明,RAD51A1和RAD51A2定位到水稻原生质体的细胞核中。这些结果使人们对OsFIGNL1在减数分裂同源重组过程中的分子机制有了更深入的认识。上述结果充分表明,OsFIGNL1基因控制水稻育性,fignl1雄性不育表型是由Os FIGNL1的功能缺失导致减数分裂过程中染色体行为异常所引起。