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背景过氧化物酶（Peroxiredoxins，Prdxs）是一类在生物体内广泛存在并且具有较高表达量的抗氧化蛋白，可以催化还原生物体内的H2O2、氢过氧化物以及过亚硝酸盐，避免细胞受到损伤。过氧化物酶分子量在22~27kDa之间，目前已知在哺乳动物中存在六种亚型（Prdx1~Prdx6），根据过氧化物酶活性位点上半胱氨酸残基的位置和数目不同，可以将其分为三类：1、典型2-Cys Prdxs；2、非典型2-Cys Prdxs；3、1-Cys Prdxs。Prdx1属于典型的2-Cys Prdxs，是Prdxs家族中分布最为广泛的成员。该蛋白除了具有抗氧化的作用外，还具有多种其他功能，参与多种生理过程包括细胞生长、细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等。此外，近年来有研究表明Prdx1在多种肿瘤中异常高表达，参与肿瘤发生发展过程中的信号调节。因此，Prdx1作为多种信号通路中的调节分子，在细胞信号通路中发挥的作用日益受到关注，成为研究的热点。目的探究杜氏盐藻Prdx1（Dunaliella salina Peroxiredoxins1，DsPrdx1）在细胞内的分子作用机制，筛选杜氏盐藻中能够与Prdx1相互作用的蛋白，并通过回交实验和体外实验对两者的相互作用进行验证。方法1、利用酵母双杂交的方法筛选杜氏盐藻Prdx1的互作蛋白设计上下游引物，利用PCR扩增杜氏盐藻Prdx1的开放阅读框，酶切鉴定和测序鉴定正确后，将扩增的杜氏盐藻Prdx1的开放阅读框与酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7进行连接，构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-Prdx1。用PEG/LiAc法将所构建的诱饵质粒pGBKT7-Prdx1分别转入酵母菌Y187与AH109中，进行诱饵质粒的自激活和毒性检测，鉴定诱饵质粒pGBKT7-Prdx1是否适用于酵母双杂交系统。以pGBKT7-Prdx1为诱饵，从杜氏盐藻cDNA表达文库中筛选与杜氏盐藻Prdx1相互作用的蛋白。经过营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶的多次筛选，获得阳性克隆。2、相互作用的验证回交实验：提取酵母双杂交阳性克隆的猎物质粒，利用PEG/LiAC的方法与诱饵质粒共转化到酵母细胞AH109中，通过营养缺陷型和α-半乳糖苷酶的筛选作用，进行验证。体外实验：提取杜氏盐藻总RNA，将提取的杜氏盐藻总RNA与已纯化的杜氏盐藻Prdx1蛋白混合，冰上孵育15min进行凝胶阻滞实验以及Prdx1保护实验，对两者的相互作用进行验证。结果1、利用酵母双杂交的方法筛选杜氏盐藻Prdx1的互作蛋白获得正确的杜氏盐藻Prdx1开放阅读框并成功构建酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-Prdx1。随后将诱饵质粒pGBKT7-Prdx1转化至酵母菌株Y187和AH109中，经过酵母双杂交诱饵质粒自激活检测和毒性实验检测，所构建的诱饵质粒pGBKT7-Prdx1对两株酵母菌AH109和Y187没有自激活作用，也没有毒性，可以用于酵母双杂交系统。利用酵母双杂交的方法，以pGBKT7-Prdx1为诱饵质粒从杜氏盐藻cDNA文库中筛选相互作用蛋白，经过筛选得到168个阳性克隆，其中包括杜氏盐藻28sRNA。Prdx1作为一种过氧化物酶，它的功能除了清除生物体内过量的过氧化物，保护细胞免受损伤外，还可以间接或者直接的作为信号分子，参与多种与氧化有关的生理过程，但是目前对于Prdx1是否在RNA的代谢过程中起作用的研究非常少。由于28s RNA不容易分离与纯化，因此本实验选择了总RNA作为后续实验的研究对象。2、相互作用的验证回交实验：提取酵母双杂交猎物质粒pGADT7-RNA并将其与酵母诱饵质粒pGBKT7-Prdx1共转入酵母菌AH109中，转化后的酵母菌在营养缺陷型培养基上生长良好，并在X-α-gal的筛选下呈蓝色，说明杜氏盐藻Prdx1与RNA在酵母菌株中存在相互作用。体外实验：构建原核表达载体pET28(a)+-Prdx1，表达杜氏盐藻Prdx1蛋白并进行纯化。提取杜氏盐藻总RNA，将杜氏盐藻总RNA与已纯化的杜氏盐藻Prdx1蛋白混合孵育，进行凝胶阻滞实验与Prdx1保护实验。最后，两个实验均证明杜氏盐藻Prdx1与杜氏盐藻RNA存在相互作用。结论以杜氏盐藻Prdx1为诱饵蛋白筛选杜氏盐藻cDNA酵母文库，发现杜氏盐藻Prdx1蛋白与RNA之间存在相互作用，经过后续的回交实验和体外实验，进一步验证了两者之间的相互作用。除了两者之间具有相互作用的关系，通过Prdx1保护试验证明Prdx1对RNA具有与较强的保护作用，提示Prdx1可能参与了RNA的代谢过程并对RNA起保护作用。