近年,随着战争战略战术的转变和爆炸性武器的广泛应用,战时肢体爆炸伤发生率日益升高。肢体爆炸伤损伤一般较为严重,多需给予紧急救治。但由于战时条件所限,我们很难对伤员进行及时的医疗后送和有效的紧急救治,从而导致伤情恶化,出现严重脏器并发症而威胁伤员生命。因此,采取有效措施以稳定爆炸伤伤情、防止严重脏器并发症的发生与发展就成了挽救伤员生命、提高救治质量和保持部队战斗力的关键。肺脏作为唯一的气体交换器官和唯一接受全部循环血量的器官,常常是继发性脏器损伤的首位靶器官。同时,肺原发性冲击伤也为继发性肺损伤提供了肥沃的土壤。因此,爆炸伤后肺损伤的防治是爆炸伤后脏器并发症防治的重点。近年来,H2S等内源性气体信号分子的发现为爆炸伤后脏器并发症的防治提供了一条新的思路。目前研究发现内源性H2S在许多生理和病理生理学过程中发挥重要作用,是机体创伤应激信号网络调控的重要分子。但尚未见H2S在爆炸伤后肺损伤中作用的相关报道。因此,本课题首先建立大鼠肢体爆炸伤模型,在此基础上研究肺胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢体系(CSE/H2S)在大鼠肢体爆炸伤后肺损伤中的作用和意义,再以离体培养的大鼠肺微血管内皮细胞(PMVECs)为实验对象,研究低浓度H2S对TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤的作用和可能机制,为肢体爆炸伤后肺损伤的防治提供新的思路。本研究主要包括以下三个部分,所取得的主要实验结果及结论如下:第一部分大鼠肢体爆炸伤后肺CSE/H2S体系变化特点实验一大鼠肢体爆炸伤模型的建立将80mg DDNP柱状纸质点爆源紧贴在大鼠左后肢胫腓骨中下段内侧皮肤处,双层棉纱布覆盖胸腹部,引爆器引爆致伤。实验发现爆炸不仅可导致严重的左后肢远段毁损伤,而且可引起严重的继发性肺损伤,满足后续实验要求。实验二大鼠肢体爆炸伤后肺CSE/H2S体系变化特点在实验一的基础上,我们进一步观察大鼠肢体爆炸伤后血浆和肺组织炎性反应和过氧化反应水平及肺CSE/H2S体系的变化情况。实验发现:大鼠肢体爆炸伤后血浆和肺组织TNF-α、IL-6、IL-10、MDA浓度和MPO活性显著升高,而SOD活性显著下降(p<0.05或p<0.01);同时,肺CSE活性和血浆H2S浓度显著下降(p<0.05),且CSE/H2S体系表达水平与肺含水量、肺间隔相对宽度、肺TNF-α浓度、MDA浓度和MPO活性等密切相关(p<0.05或p<0.01)。提示CSE/H2S体系可能参与了爆炸伤后肺损伤过程的调节。第二部分H2S在大鼠肢体爆炸伤后肺损伤中的作用实验一硫氢化钠对健康大鼠急性毒理作用观察第一部分实验提示肺CSE/H2S体系可能参与了大鼠肢体爆炸伤后肺损伤过程的调节。本部分实验则通过给予H2S外源性供体(NaHS)或肺内源性H2S合成酶CSE抑制剂(PPG)的方法,进一步探索肺CSE/H2S体系在此过程中的具体作用。本实验则旨在观察H2S外源性供体NaHS的毒副作用,以选择合适的NaHS给药剂量。实验发现NaHS腹腔注射剂量≥30mg/kg后大鼠出现急性中毒表现,且随注射剂量增大而逐渐加重,甚至发生“闪电型”死亡;而≤10mg/kg NaHS的注射剂量尚不至于引起明显的急性中毒表现,此NaHS注射剂量可作为H2S给药剂量用于后续实验。实验二H2S在大鼠开阔地肢体爆炸伤后肺损伤中的作用在实验一的基础上,我们通过腹腔注射H2S外源性供体NaHS或肺内源性H2S合成酶CSE抑制剂PPG的方法,观察肺CSE/H2S体系在大鼠开阔地肢体爆炸伤后继发性肺损伤中的作用。实验发现:早期给予NaHS(1, 5, 10mg/kg, ip)后伤鼠血浆和肺组织TNF-α、IL-6、IL-10、MDA浓度和MPO活性比单纯爆炸致伤组显著降低,而SOD活性显著升高(p<0.05或p<0.01),肺充血、水肿、炎细胞浸润程度亦明显减轻;给予PPG则反之(p<0.05或p<0.01)。提示肺CSE/H2S体系在大鼠开阔地肢体爆炸伤后继发性肺损伤过程中发挥脏器保护作用。实验三H2S在大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤中的作用本实验旨在通过给予H2S外源性供体NaHS或肺内源性H2S合成酶CSE抑制剂PPG的方法,研究肺CSE/H2S体系在大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤中的作用。实验发现大鼠舱室内肢体爆炸致伤后肺CSE活性和血浆H2S浓度显著下降,肺组织首先出现出血和肺泡结构破坏等原发性冲击伤表现,随后逐渐出现肺水肿、炎细胞浸润等;早期给予NaHS(5mg/kg NaHS,ip)则可显著减轻大鼠肺出血、水肿、炎细胞浸润程度,血浆和肺组织TNF-α、IL-6、IL-10、MDA浓度和MPO活性亦比爆炸致伤组显著降低,而SOD活性显著升高(p<0.05或p<0.01)。提示肺CSE/H2S体系在大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤过程中亦发挥脏器保护作用。第三部分低浓度H2S对TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤的作用实验一大鼠PMVECs的培养与鉴定前期实验发现肺CSE/H2S体系在大鼠肢体爆炸伤后肺损伤过程发挥脏器保护作用。鉴于肺微血管内皮细胞(PMVECs)在肺损伤过程中的重要性,本部分实验采用在培养基中加入H2S(100,300μM NaHS)的方法,观察低浓度H2S对TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤的作用。本实验采用组织块法培养出后续实验所需大鼠PMVECs。实验发现:肺组织块培养24h后PMVECs开始爬出,起初细胞呈单个散在分布或数个聚集成群。培养48h～60h后细胞单层贴壁生长,呈典型的“铺路石”样排列;细胞椭圆形、短梭形状、多角形或不规则形;核大居中,圆形或椭圆形,胞浆丰富。培养细胞经FⅧ-Ag间接免疫荧光检测证实为PMVECs,且细胞纯度满足后续实验要求。实验二低浓度H2S对TNF-α诱导的大鼠PMVECs损伤的作用本实验采用在培养基中加入H2S(100, 300μM NaHS)的方法,观察低浓度H2S对TNF-α诱导的PMVECs损伤的作用。实验发现:20ng/ml TNF-α刺激PMVECs后,细胞表达、分泌ICAM-1和IL-6量显著增加,上清MDA浓度、LDH活性、iNOS/NO量亦显著升高,而SOD活性显著下降(p<0.05或p<0.01),在此过程中Nrf2入核量增加(p<0.01)。与TNF-α刺激组比较,低浓度H2S可以显著减少PMVECs表达分泌ICAM-1和IL-6量,上清MDA浓度、LDH活性和iNOS/NO量亦显著降低, SOD活性则显著升高(p<0.05或p<0.01);在此过程中Nrf2入核量进一步增加(p<0.01)。提示低浓度H2S可能通过Nrf2和iNOS/NO途径等发挥抗细胞损伤作用。上述研究结果提示:1.大鼠开阔地肢体爆炸伤(80mg DDNP纸质点爆源紧贴大鼠左后肢胫腓骨中下段内侧皮肤爆炸致伤,双层棉纱布覆盖胸腹部后引爆致伤)可引起严重继发性肺损伤,肺组织炎性反应和过氧化反应显著增强,肺充血、水肿和炎细胞浸润明显。2.大鼠舱室内肢体爆炸伤后肺损伤为原发性肺冲击伤和继发性肺损伤的叠加,肺组织炎性反应和过氧化反应显著增强,肺出血和肺泡结构破坏严重,损伤明显重于开阔地爆炸致伤。3.肺CSE/H2S体系在大鼠开阔地/舱室内肢体爆炸伤后肺损伤过程中发挥肺保护作用,其表达下调参与了爆炸伤后肺损伤过程的调节,早期给予低剂量H2S(1～10mg/kg NaHS)可显著减轻大鼠肢体爆炸伤后肺损伤。4.低浓度H2S(100～300μM)可启动PMVECs内源性抗损伤系统,抑制TNF-α诱导的细胞活化,减轻细胞损伤,发挥显著的抗细胞损伤作用。Nrf2和iNOS/NO可能参与了抗细胞损伤过程的调节。