背景及目的:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)一类发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞病,是全球第二常见的血液系统肿瘤。数据显示:全球MM患病人数达75万人左右,全球每年新发病例约为11.40万人,属于罕见性的恶性肿瘤之一。中国MM的发病率已经超过急性白血病,跟全球的发病趋势类似,是仅次于非霍奇金淋巴瘤之后居于第二位的血液系统恶性肿瘤,而且在多种因素影响下,近年MM已有发病比率上升、发病年龄提前的趋势。MM的特征在于骨髓中恶性浆细胞的异常扩增,导致血液和尿液中单克隆免疫球蛋白的过量产生,肾功能受损,贫血,溶骨性骨病变和患者的反复感染等多种损害。此外,MM患者可能具有免疫缺陷,严重影响病人的生活质量和寿命。在过去十几年中,MM细胞分子机制方面的研究取得了突飞猛进的进展,也开发了相应的新的治疗策略。在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中存在数个lnc RNA的异常表达,同时它们的临床意义,生物学功能和潜在的分子机制也得到了文献报道。然而,尽管lnc RNAs家族有众多的成员,但只有少数与MM预后相关。许多尚未发现的lnc RNA也可能与MM进展和患者结果有关。此外,单一指标的预测能力有限,临床上需要由多个指标组成的预后模型来进行肿瘤预后的综合临床评估。结合若干预后指标的预后模型已用于多种其他肿瘤,但包含lnc RNA和m RNA的MM预后模型及它们之间的关联尚未见报道。自噬(autophagy)作为细胞内“清道夫”,已经广为人知。自噬是一个生物学过程,包括吞噬自身细胞质蛋白或细胞器进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,从而降解其所吞噬的内容物。自噬是固有的,存在于细胞内用来降解非必须或者错误折叠的细胞组分的过程,单词autophagy来自于希腊语,auto=self,phagy=phagein=eat,即吃掉自己的意思。但是自噬在肿瘤领域中似乎作用并不明确,有时它可启动II型程序性死亡,可发挥杀伤肿瘤细胞的作用,有时又能提高肿瘤细胞对应激的耐受能力,提高肿瘤细胞的存活率。故自噬就是一把双刃剑,对肿瘤细胞可能通过促进与抑制的双重作用来发挥作用。而这一双刃剑特性也为临床肿瘤防治工作提供了两种完全相反的方向:有可能通过抑制自噬提高抗肿瘤的疗效,或者通过激活自噬从而诱导肿瘤细胞发生自噬性死亡而达到治疗效果。自噬在浆细胞个体发育和MM的病理过程中发挥重要作用。自噬通常被认为参与多发性骨髓瘤细胞的促生存机制,并与泛素蛋白酶体系统共同作用,通过降解过度的和错误折叠的蛋白质来维持多发性骨髓瘤细胞的体内平衡,从而进行能量回收。因此,抑制自噬可有效诱导MM细胞死亡,并可与蛋白酶体抑制剂协同作用。然而,自噬的过度激活也可能导致诱导自噬性细胞死亡的细胞器的过度降解。因此,自噬性细胞死亡的激活也可能代表治疗MM的有希望的方法。自噬的过程由自噬相关基因(autophagy-related genes,ARGs)介导。此前,研究人员已经确定了234种ARGs,为癌症研究提供便利。一些使用了这些ARGs的研究表明,这些ARGs在各种类型的癌症中具有显着的临床意义,包括神经胶质瘤,肝癌和甲状腺癌。但ARGs在MM中的临床意义,特别是预后价值未见报道。在某种疾病中药物的作用机制可能依赖于该疾病的分子事件改变和表观遗传过程。目前,疾病相关的高通量数据广泛的存储在各种公共数据库中。来自微阵列(microarray)和RNA测序(RNA-sequencing,RNA-seq)的数据已被编译置入Gene Expression Omnibus(GEO),Array Express或Sequence Read Archive(SRA)数据库。既往MM相关的研究未利用预后相关基因进行MM潜在药物的研究,留下了一定的缺憾。故本研究分三部分进行:第一部分首先筛选了具有MM预后数据的基因芯片,并统计分析了与预后密切相关的lnc RNA和m RNA。继而进行了预后lnc RNA和m RNA之间的关系的网络图绘制,并选择部分lnc RNA和m RNA来构建MM预后模型。该MM预后模型有望为MM的临床应用提供新方向。第二部分继续利用计算生物学的方法,提取有预后意义的ARGs并构建预后模型,进一步揭示自噬与MM预后的关系,也为MM的临床预后判断提供新的视角。第三部分我们首先将具有预后价值的m RNA表达谱进行延伸,全面分析这些基因群富集的gene ontology(GO)通路和KEGG通路情况,并使用CMAP预测与MM预后相关的药物,最后选择部分药物和靶标进行分子对接,验证药物与靶标之间的关系,为“旧药新用”提供生物信息依据。材料及方法:1对来自Genome Expression Omnibus(GEO)的芯片数据集(GSE24080)中的558个MM患者的lnc RNA和m RNA数据进行计算生物学挖掘。2使用R软件的存活包计算所有基因的预后评估价值。使用多变量Cox分析研究排名前20个最重要的预后相关m RNA和lnc RNA,并构建预后评估模型。使用R软件中的survival ROC包测试预后模型的效能,通过将预后相关的基因的表达水平乘以其对应的系数来导出每个患者的预后特征。并使用时间相关的接收者-操作者特征(time dependent receiver-operator characteristic,ROC)曲线进行预后价值的进一步评估。使用加权相关网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA)探讨lnc RNA和m RNA之间的关系,最后使用Cytoscape软件构建lnc RNA-m RNA网络。3 GSE24080中含54,675个探针,从中获取234个自噬相关基因(ARGs)表达谱。通过单变量COX分析鉴定与MM的无事件生存率(event-free survival,EFS)显著相关的ARG。通过R软件的survival ROC包分析ARG的生存预测价值。为了揭示这些预后ARG的除了自噬之外的分子功能特征,我们通过使用R package cluster Profiler进行功能富集分析,包括基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)。为了开发基于ARG的预后指数,本部分进行多变量COX回归。然后,通过将预后相关的ARG的表达水平乘以其对应的系数来导出每个患者的预后特征。通过使用GSEA,测试了激活/抑制基因特征是否在高风险和低风险病例中获得富集。4用MM中的所有预后基因进行GO和KEGG分析。将保护性和风险基因上传到Connecting Mapping(CMAP)软件以鉴定现有药物的潜在未知作用。并选择一个例子使用Sybyl-X 2.0来进行分子对接的验证。结果:1单变量Cox回归分析确定了39个lnc RNA和1445个m RNA与MM患者的EFS显著相关。2选择前20个最重要的与预后相关的lnc RNA和mRNA作为分析独立MM预后因子的候选者。基于m RNA和lnc RNA的预后模型都可以用于将患者分成“预后较好”和“预后不良”两组。对于lnc RNA模型,ROC的AUC为0.739,对于m RNA模型,则为0.732。在lnc RNAs-m RNAs网络中,总共143个m RNA与23个预后相关的lnc RNA正相关或负相关。NCRNA00201,LOC115110和RP5-968J1.1有可能成为MM中促进疾病进展和影响病人预后的最主要的驱动基因。3单变量Cox回归分析确定了55个与MM的无事件生存率显著相关的ARG。此外,通过多变量Cox回归分析发现了16个预后相关的ARGs,并构建了基于ARG的预后评估指数,包括ATIC,BNIP3L,CALCOCO2,DNAJB1,DNAJB9,EIF4EBP1,EVA1A,FKBP1B,FOXO1,FOXO3,GABARAP,HIF1A,NCKAP1,PRKAR1A,SUPT20H和TM9SF1。使用这种预后模型,MM患者可以分为具有不同临床转归的高风险组和低风险组。ROC曲线的AUC值在3年,5年和10年的预测价值分别为0.740,0.741和0.712。4在与MM患者的EFS显著相关的1,445个基因中,包括676个保护性指标和769个风险指标。KEGG信号通路分析显示这些预后相关基因富集于“细胞周期”,“DNA复制”和“P53信号传导途径”通路中。本部分结果提示三个潜在药物伏立诺他,三氟拉嗪和硫利达嗪通过靶向这些预后基因发挥作用。基于PPI网络分析,CDK1在MM的预后相关基因中被列为核心基因。使用Sybyl-X 2.0对排名前10的药物进行与CDK1的分子对接,大多数显示出与CDK1的高结合力。在这些药物中,曲古抑菌素A与CDK1结合的能力最强。结论:1本研究构建了基于m RNA和lnc RNA表达谱的MM预后的模型,这些m RNA和lnc RNA可以形成相应的网络结构,为MM的临床诊断和治疗提供了新的视角,为解释MM发病机制提供了新的方向。2自噬可能在MM的进展中发挥重要作用,基于ARGs的预后模型将为MM的临床应用提供更新的思路。3在“细胞周期”通路中富集的基因在MM的进展和预后中起重要作用,这些预后相关基因在MM药物开发中也具有重要价值。